Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
СНз-0-(СН2)2-0-(СН2)2-0-(СН2)2-0-(СН2)2СО-- (I)
СН3 СН2 (СН2)2-0-(СН2)2-0-(СН2)2-0-(СН2)2С0- (11)
CHj СН2 (СН2)2 СН2 (CH2)2-0-(CH2)2-0-(CH2)2C0- (III)
СН3 СН2(СН2)2 СН2(СН2)2 СН2 (CH2)2-0-(CH2)2C0~ (IV)
CHj СН2(СН2)2 СН2(СН2)2 СН2 (СН2)2 СН2 (СН2)2СО- (V)
Рис. 8.3. Различные группы, присоединенные к поверхностным лизиновым
остаткам термолизина [51]. Гидрофобность модифицирующих групп возрастает
от I к V, что обуславливает их различное влияние на термическую
устойчивость модифицированного фермента.
Еще один способ стабилизации белка заключается в связывании его с
водорастворимым полимером. Так, связав аденозиндеаминазу с декстраном
(активированным цианбромидом), авторы [39] получили продукт, активность
которого (при повышенной Км и снизившейся /скат) составляла всего 13% от
активности нативного фермента. Однако при этом увеличилось (с 1 до 2 ч)
время снижения активности фермента вдвое при 60° С.
8.3.3. Модификация с изменением специфичности
Изменить субстратную специфичность фермента можно при помощи множества
методов; они рассмотрены в недавнем обзоре [24].
Протеазы часто обладают также эстеразной активностью. При ацетилировании
в карбоксипептидазе А всего двух тирозиновых остатков наблюдается
шестикратное усиление эстеразного действия, протеолитическая же
активность фактически утрачивается. Панкреатические рибонуклеазы (РНКазы)
подвергали многим химическим модификациям. Интересна димеризация фермента
с помощью сшивающего агента диметилсуберимидата. Нативный фермент
представляет собой мономер с низкой активностью по отношению к
двухцепочечной РНК, однако после сшивки гидролитическое действие фермента
на двухцепочечную РНК усиливается в 78 - 440 раз. При сшивке этого
фермента в присутствии ингибитора индолпропионовой кислоты у него
появляется также эстеразная активность, что предположительно связано с
осуществлением сшивки при необычной конформации фермента.
Ферменты, катализирующие окислительные реакции, в соответствующих
условиях также часто проявляют измененную специфичность. Например, при
обработке лизин-монооксигеназы реагентами, взаимодействующими с тиольными
группами, можно добиться перехода от монооксигеназных реакций к
оксидазным (рис. 8.4). В случае моноаминоксидазы тип реакции остается тем
же, но модификация приводит к потере активности по отношению к природному
субстрату тирамину и повышению активности к гистамину. При модификации
флавопротеиндегидрогеназ их акцепторная специфичность может меняться так,
что диапазон соединений, восстанавливаемых этими ферментами, расширяется
и, кроме NAD(P+) + , включает красители и кислород. Фактически эти
ферменты из дегидрогеназ превращаются в оксидазы, как, например, в паре
ксантиндегидрогеназа/оксидаза [25]. Глутатионредуктаза катализирует
реакцию
GSSG + NADPH + Н+ -> 2GSH + NADP+.
110
Глава 8
.COO-
+NH3(CHz)Cbr
NH3
+NH3(CH2)4CO- COO-+NH3+ HzOz
(I)
+ NH3(CHz)4CONH2+ co2+hzo
(in
Puc. 8.4. Реакции лизинмонооксигеназы, действующей либо как оксидаза (I),
либо как монооксиге-наза (II). Реакция II является физиологической, а
реакция I индуцируется путем модификации лизиновых остатков в ферменте.
Модификация лизиновых остатков фермента тринитробензолсульфонатом
приводит к частичному сохранению NADPH-оксидазной и полной потере
глутатионредуктазной активности [6].
8.3.4. Присоединение кофермента
Интересная и потенциально полезная модификация фермента заключается в
присоединении к полипептидной цепи кофермента, который обычно свободно
диффундирует. Этот способ был описан в работе [30] на примере комбинации
аналога NAD и алкогольдегидрогеназы. Полученный в этой работе конъюгат
содержал приблизительно одну молекулу кофермента на активный центр, а его
активность составляла около 20% активности системы фермент/растворимый
кофермент. Во второй публикации тех же авторов [31] показано, что этот
конъюгат может быть вовлечен в оборот другой (лактат) дегидрогеназы.
Такой подход можно распространить на ADP/ATP-, птерин- и фолат-зависимые
системы. При его использовании для функционирования биосенсора не
требуется добавления в систему кофермента, что, конечно, является
преимуществом.
8.3.5. Новые типы ферментативной активности
Возможность придания белку совершенно нового типа ферментативной
активности путем его химической модификации была реализована лишь в
немногих случаях. Стратегия модификации здесь заключается в усилении
слабой каталитической активности органической молекулы путем ковалентного
связывания ее с белковой цепью, чтобы использовать способность последней
связывать субстрат. Один из лучших примеров этого рода-флавопапаин [23].
Папаин представляет собой протеазу растительного происхождения, которая
содержит каталитически активную тиольную группу. Обработка папаина
бромоизоаллоксазинами приводит к ковалентному присоединению редокс-групп
к тиолу [23], как показано на рис. 8.5. Модифицированный таким образом
фермент теперь не проявляет протеолитической активности, но зато
