Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
проявляет оксидазную. Производное папаина, полученное алкилированием
цистеинового остатка активного центра, обладает слабой способностью к
окислению дитиолов [18] и дигидроникотинамидов [26, 27]. Окисление
дитиолов протекает лишь несколько более быстро по сравнению с самим
изоаллоксазином; обычно скорость реакции возрастала в 4-17 раз при
значениях ккат/Км, равных 4-21 М 'сч [18]. Анализ молекулярных моделей
показал, что при окислении дигидроникотинамида более активным
катализатором должно быть другое производное папаина, и это предположение
подтвердилось.
Белковая инженерия и ее приложения в оиосенсорах
R СН3
О (П)
Рис. 8.5. Производные флавина, используемые для синтеза флавинопапаина (X
= Вг- или S-nanauu). Производное I (X = S-папаин) существенно менее
активно, чем П.
По сравнению с не связанной в комплекс группой в присутствии
модифицированного папаина скорость окисления возрастает в 4-621 раз, в
зависимости от дигидронико-тинамида, а для лучшего субстрата отношение
kK.iT/KM составило 5,7-105 М-1с-1, что сравнимо с величиной, характерной
для природных флавоферментов [27]. Кроме того, это производное папаина
проявляло некоторые типичные свойства ферментов, в том числе кинетику с
насыщением и стереохимическую предпочтительность атома водорода 4А при
окислении NADH [28].
Модификация активного центра-не единственный способ создания новой
ферментативной активности. Авторы [32] метили три поверхностных
гистидиновых остатка миоглобина группами пентамминрутения. После
модификации у гемового центра появилась способность прочно связывать
анионы. Еще интереснее то, что такой гем проявляет также выраженную
кислород-зависимую аскорбат- и дурогидрохинонокси-дазную активность.
8.3.6. Частичный синтез белков
В настоящее время химический синтез замещенных белков из природных
аминокислот вытеснен методом олигонуклеотидного мутагенеза (см. выше).
Химические методы применяют, только если требуется замещение необычной
аминокислотой. Детально эта область рассматривается в обзоре [9] и книге
Оффорда [35].
8.3.7. Модификация иммобилизацией
Иммобилизацию белков на самых разных носителях используют для решения
множества химических задач. Этот вопрос подробно рассмотрен в монографиях
[10, 34, 59], а также в гл. 6. Аналитические приложения иммобилизации
описаны в [7]. Из-за недостатка места мы не можем отдать должное всем
работам в этой области. Читателю, желающему получить более детальные
сведения, рекомендуем обращаться к упомянутым выше источникам и к
оригинальным работам. В этом разделе мы лишь отметим некоторые типичные
эффекты, связанные с иммобилизацией.
8.3.7.1. Кажущаяся активность фермента. После иммобилизации кажущаяся
активность фермента часто уменьшается. Это может быть обусловлено рядом
факторов. Иногда химические процессы, протекающие при иммобилизации,
приводят к модификации активного центра, что сказывается на его
каталитической функции. Этого можно было ожидать, так как многие
аминокислотные остатки, входящие в активный центр, обладают повышенной
реакционной способностью, хотя они и могут быть стерически защищены. Если
такая инактивация действительно имеет место, то следует либо подыскать
другой химический способ связывания фермента с носителем, либо выбрать
условия, в которых подавляется реакция на активном центре, например
проводя иммобилизацию в присутствии субстрата, продукта или ингибитора.
112
Глава 8
Даже если иммобилизация непосредственно не влияет на фермент-субстратную
реакцию, природа носителя может приводить к возникновению диффузионных
барьеров. Так, изучая реакционную способность цитохрома с,
иммобилизованного на гранулированной агарозе [41], авторы обнаружили,
что, хотя потерю активности цитохрома с при взаимодействии с обеими
оксидазами и, в меньшей мере, редуктазой удалось предотвратить, реагирует
лишь цитохром, связанный с поверхностью гранул. Для используемых в
качестве субстрата митохондриальных частиц недоступна большая часть
цитохрома с, находящегося внутри пористых гранул. Аналогичные результаты
получены и с иммобилизованными гидролазами: их кажущаяся активность в
случае субстратов с небольшими молекулами выше, чем для макромолекул. В
общем случае гранулированные носители создают меньше диффузионных
ограничений, чем волокнистые, а на плоских поверхностях реакции
развиваются быстрее, чем в пористых материалах.
С другой стороны, при некоторых обстоятельствах, особенно в случае
сопряженных ферментных систем, иммобилизованный препарат может проявлять
более высокую кажущуюся активность, чем в растворе. При совместной
иммобилизации создаются условия для направленного потока субстрата, в
результате чего сокращается его диффузионный путь между ферментами, иными
словами, более высокая локальная концентрация промежуточного продукта
приводит к увеличению кажущейся активности.
Таким образом, чтобы оптимизировать активность и время отклика системы,
необходимы тщательный выбор носителя и химического способа иммобилизации.
