Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-7 (1977).
16. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 98, 503-17 (1975).
17. Turner A.P.F., Pickup J.C. Diabetes mellitus: Biosensors for research
and management. Biosensors, 1, 85-115 (1985).
18. Zoller M.J., Smith M. Oligonucleotide directed mutagenesis using M13
derived vectors: An efficient and general procedure for the production of
point mutations in any fragments of DNA. Nucl. Acids Research, 10, 6487-
500 (1982).
Глава 8
Белковая инженерия и ее возможные приложения в биосенсорах
Энтони Э. Г. Касс, Энда Кенни
8.1. Введение
Эта глава посвящена возможным приложениям белковой инженерии в
биосенсорах. Белковая инженерия, рассматриваемая здесь в широком смысле,
направлена на модификацию ковалентной структуры белка путем добавления,
замены или исключения отдельных групп, в результате чего химические
свойства белковой молекулы становятся отличными от ее природных свойств.
Химические свойства белка, включаемые в это определение, могут быть
самыми разнообразными - от катализа ферментом совершенно необычных для
него реакций вследствие сдвига субстратной специфичности до увеличения
времени сохранения биологической активности фермента в определенных
условиях.
Механизмы, позволяющие добиться подобных изменений, весьма разнообразны.
Можно, например, модифицировать нуклеотидную последовательность ДНК,
которая кодирует представляющий интерес белок, чтобы аминокислотная
последовательность белка изменилась определенным образом. Можно ввести
природный белок в биосенсор гак, чтобы его свойства изменились вследствие
взаимодействия с другими компонентами прибора. Прежде чем рассмотреть
природу изменений, которые могут быть полезны при модификации белков
специально для биосенсорных приложений, целесообразно обсудить некоторые
свойства белков, влияющих на их функционирование в биосенсоре.
При определении характеристик сенсора важное значение, очевидно, имеют
кинетические параметры /скат и Км. Загрузка биосенсора ферментом обычно
относительно велика и, следовательно, большое значение кКЛТ (число
оборотов фермента) означает, что на самом деле требуются малые количества
фермента (миллиграммы). В специфическом, но важном случае мембранных
сенсоров при высоком /скат лимитирующей стадией в работе прибора
становится мембранный транспорт и, таким образом, сенсор относительно
нечувствителен к количеству или потере активности фермента.
Теперь обратимся к константе Михаэлиса Км. Она влияет прежде всего на
диапазон линейности сигнала. В идеальном случае связь между выходным
сигналом и концентрацией определяемого вещества должна быть линейной. В
общем виде связь отражается в величине Км (или кажущейся Км) фермента.
Анализ уравнения Михаэлиса -Ментен показывает, что линейность сохраняется
вплоть до концентраций более .0,2 Км, хотя важное значение имеют другие
факторы, такие как иммобилизация фермента или наличие мембраны. Отношение
двух величин /скат/Км есть константа специфичности. Желательно, чтобы для
определяемого вещества она была значительно выше, чем для других
потенциальных субстратов.
Влияние температуры на работу биосенсора часто определяется несколькими
различными конкурирующими процессами. Как и в случае любой химической
реакции, скорость ферментативной реакции возрастает с увеличением
температуры. Таким
Белковая инженерия и ее приложения в биосенсорах
101
образом, отклик сенсора также должен зависеть от температуры, причем
величина этого эффекта определяется энергией активации лимитирующей
стадии. Ферменты подвергаются также термической инактивации, и ее
скорость зависит от энергии активации развертывания белка и температуры.
Наконец, даже если фермент стабилен, сенсор может давать двухфазный
сигнал при изменении лимитирующей стадии. Кроме температуры, к
денатурации, влекущей потерю активности, может приводить множество других
причин; увеличение общей "устойчивости" биологического компонента
способствует практическому применению биосенсоров.
Если активность фермента зависит от ионизирующихся групп, то еще одним
фактором, влияющим на отклик биосенсора, является pH. Чтобы сенсор был
"совместим" с матрицей анализируемой пробы, может потребоваться изменить
положение и протяженность оптимального интервала pH. При низких или
высоких значениях pH белки также подвергаются денатурации; это может быть
особенно важно при анализе пищевых продуктов или напитков, где пробы
часто бывают довольно кислыми.
Наконец, при необходимости иммобилизации биологического компонента может
оказаться, что аминокислотные остатки, обеспечивающие связь с носителем,
важны также и для каталитической активности фермента. Тогда приходится
использовать иной метод иммобилизации. Некоторые потенциальные приложения
белковой инженерии в области биосенсоров перечислены ниже:
1. Увеличение числа оборотов фермента.
