Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
когда потребовалось получить чистую глюкозодегидрогеназу (GDH) [9]. Этот
фермент в принципе можно использовать в глюкозном сенсоре. Такой сенсор
обладал бы большей чувствительностью, чем глюкозные сенсоры на основе
глюкозооксидазы (GOD), и в отличие от последних не требовал бы кислорода
[8, 17]. В наших исследованиях источником GDH служили бактерии
Acinetobacter calcoaceticus. Выход фермента из этих микроорганизмов,
однако, невысок [2], поскольку его содержание, видимо, очень мало. Роль
фермента в организме бактерии неясна, но, вероятно, он имеет отношение к
энергетическому метаболизму. Глюкозодегидрогеназа состоит из апофермента
и кофактора PQQ, который служит кофактором и для нескольких других
дегидрогеназ в различных организмах. Можно было бы ожидать, что
молекулярное клонирование генов, кодирующих апофермент, и их экспрессия в
другом микроорганизме, например Е. coli, облегчит выделение GDH.
Существуют три способа улучшить технологию получения фермента:
1. Кодирующий ген можно клонировать в мультикопийные плазмидные векторы.
Тогда клетка может содержать до 50 копий таких плазмид, следовательно,
представляющий интерес ген будет присутствовать в ней в большом числе
копий и может произвести большее количество требуемого продукта.
2. Представляющий интерес ген может быть введен в плазмиду так, чтобы он
находился вблизи сильного промотора (для данного организма-хозяина).
Промотор представляет собой сайт ДНК, ответственный за трансляцию белка
на матричной РНК в рибосоме. Поэтому использование так называемого
экспрессированного вектора данного типа делает транскрипцию и трансляцию
более эффективными, тем самым приводя к увеличению производства белка.
Сконструирован ряд плазмид, которые содержат сайты рестрикционных
ферментов, что позволяет вставлять чужеродную ДНК в непосредственной
близости от эффективного промотора.
3. Для некоторых систем созданы плазмиды, известные как секретирующие
векторы. Такие плазмиды производят клонирующий ген, который секретируется
в культуральную среду. Это обеспечивает очевидные преимущества при
выделении и очистке фермента.
Генная инженерия
97
Найдено, что кофактор PQQ связывается с несколькими ферментами, в том
числе метанолдегидрогеназой, способствующей окислению метанола в
метилотрофных бактериях [10]. Выделить метанолдегидрогеназу из этих
микроорганизмов нетрудно, следовательно, и получение кофактора не
является проблемой. Более того, показано, что при объединении PQQ из
других источников с апоферментом GDH получается активный холофермент.
Поэтому в данном случае необходимо клонировать только ген, который
кодирует апофермент.
Выше в качестве примера мы использовали фермент из прокариотического
организма. Описанная методика, однако, имеет особое значение для сенсоров
на основе ферментов из высших животных и растений. Производство таких
ферментов часто является дорогостоящим, поскольку их концентрация в
клетках мала и, кроме того, выращивание клеток высших организмов в
лабораторных культурах-процесс довольно медленный и связан со
значительными техническими трудностями.
7.3.2. Улучшение свойств ферментов
Вторая область приложения молекулярной биологии в сенсорной технике
связана с современными методами мутагенеза, используемыми для ферментной
инженерии (см. гл. 8). Эти методы позволяют изменить активный центр
фермента с тем, чтобы увеличить число оборотов для определенного
субстрата. Таким путем можно также сузить или расширить диапазон
субстратов данного фермента. При этом фермент может стать более пригодным
для решения задачи, стоящей перед исследователем. Предварительным
условием проведения подобной работы является знание третичной структуры
фермента, обычно определяемой с помощью рентгеновской кристаллографии.
Это необходимо, чтобы определить, какая область белка формирует активный
центр. После этого в ДНК можно заменить соответствующую пару оснований,
что приведет к замене определенного аминокислотного остатка в белковой
цепи. Первой стадией в этой процедуре может быть введение представляющего
интерес гена в небольшую плазмиду и клонирование его в Е. coli. Далее,
используя описанную выше методику, можно определить нуклеотидную
последовательность гена, произвести в ней замену соответствующей пары
оснований. Затем прослеживают влияние этой замены на свойства фермента.
Этот метод применим к почти любому ферменту, если имеется достаточно
информации о его третичной структуре.
7.3.3. Генетическое манипулирование целыми организмами, используемыми в
сенсорах
В тех случаях, когда применение бесклеточных ферментных сенсоров
затруднено, используют сенсоры на основе целых микроорганизмов. Примером
может служить рассмотренный в гл. 2 метановый сенсор на основе
метанотрофных бактерий. В этом сенсоре биокатализатором является
метанмонооксигеназа, которая способствует окислению метана в метанол [7].
Использовать данный фермент в бесклеточной системе почти невозможно, так
