Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
комплементарная ДНК (кДНК), не содержащая интронов.
Фрагмент ДНК, который предполагается экспрессировать в бактерии, получают
с помощью следующей процедуры. ДНК разрезают на части, используя
рестрикционные
92
Глава 7
Рис. 7.3. Клонирование эукариотической ДНК. Сначала выделяют матричную
РНК, кодирующую требуемый продукт, поскольку она не содержит интронов
(рис. 7.2). Затем ее обрабатывают вирусным ферментом обратной
транскрипта-зой, которая генерирует последовательность ДНК, не содержащую
интронов. Обычно получается двухцепочечная ДНК со шпилькой на одном
конце, которую удаляют ферментом нуклеазой S1, специфически разрезающей
шпильку. В результате получается комплементарная ДНК (кДНК), пригодная
для клонирования в "хозяине"-прокариоте (бактерии).
эндонуклеазы [11]. Эти ферменты разрезают ДНК всюду, где находятся
определенные специфические нуклеотидные последовательности, оставляя на
концах каждого фрагмента короткие шпильки. Аналогичной обработке
подвергают плазмиду-небольшой автономно реплицирующийся участок
бактериальной ДНК. Затем оба фрагмента ДНК разного происхождения
объединяют, используя фермент, называемый ДНК-лигазой. Далее
рекомбинированную ДНК вводят в бактерию. Обычно это достигается путем
генетической трансформации, в ходе которой при определенных условиях
голая ДНК проникает в бактерию и затем реплицируется. Таким образом
теперь мы имеем рекомбинантную молекулу, существующую в новом хозяине.
Плазмиды, используемые как клонирующие векторы, содержат специальные
генетические маркеры, например гены устойчивости к определенным
антибиотикам, и, таким образом, после трансформации содержащие плазмиды
клетки могут быть отобраны селекцией. Если чужеродные ДНК внедряются в
середину одного из маркерных генов, рекомбинанты его утратят; такие
рекомбинантные микроорганизмы, очевидно, чувствительны к маркерному
антибиотику, что можно использовать для их выявления. Процедура,
называемая вставочной инактивацией, иллюстрируется рис. 7.4. "Чужеродные
гены" либо экспрессируются, либо не экспрессируются; это значит, что
бактерия может проявлять признаки, кодируемые клонированными генами, но
может и не проявлять их. В последнем случае представляющие интерес гены
можно переклонировать в плазмиды, специально сконструированные так, чтобы
облегчить экспрессии клонируемых генов. Вместо бактериальной плазмиды в
качестве клонирующего вектора можно использовать некоторые бактериофаги
(бактериальные вирусы). На рис. 7.5 показан
7. Изолированная после сплайсинга мРНК
Г?н, не содержащий интронов
Обратная
транскриптаза
Z. Двухцепочечная ДНК
Шпилька
Нуклеаза S1
3. Двухцепочечная ДНК (к ДНК)
I 'енная инженерия
93
Л
Рестрикция ферментом одного сайта в гене
резистентности т к сслорамфеникапу
Рис. 7.4. Использование вставочной инактивации для идентификации
рекомбинантных молекул. В плазмиде в гене резистентности к хлорамфениколу
имеется единственный сайт для определенного рестрикционного фермента.
Именно сюда вставляется чужеродная ДНК. Микроорганизмы, которые приобрели
такие рекомбинантные ДНК, легко распознаются, поскольку они чувствительны
к хлорамфениколу (вставка нарушает структурную целостность гена
резистентности к хлорамфениколу), но остаются резистентными к
ампициллину.
жизненный цикл бактериофага лямбда Escherichia coli, который является
лучшим из известных фаговых клонирующих векторов. На его основе
разработано много других клонирующих векторов [5]. Техника клонирования с
помощью фаговых векторов аналогична клонированию с использованием
плазмид. Однако при этом рекомбинанты выделяют в виде бактериофаговых
бляшек, а не интактных бактериальных клеток. Бляшки представляют собой
круглые прозрачные клетки в зоне роста бактерий на пластинке, возникающие
в результате инфекции фагом хотя бы одной бактерии. Фаг лизирует
бактерию, при этом образуется несколько тысяч его копий, которые затем
инфицируют окружающие клетки. Пока наилучшей системой для клонирования
ДНК является Е. coli, но аналогичные системы разрабатываются и для ряда
других бактерий, как грам-положительных, так и грам-отрицательных. Сюда
входят Pseudomonas,
94
Глава 7
Рис. 7.5. Жизненный цикл бактериофага Лямбда. Внедрившись в бактерию-
хозяина, фаг может либо войти в литический цикл, либо включиться в
бактериальную хромосому, с которой он подвергается репликации (лизогенное
состояние). В дальнейшем на некотором этапе фаг может опять стать
литическим - этот процесс можно инициировать УФ-облучением лизогенов.
Литический цикл-это вегетативный процесс, в конце которого клетка-хозяин
лизирует, освобождая большое число фагов. За упаковку реплицированной ДНК
в оболочку фага ответственны "cos''-сайты.
Bacillus и Streptomyces. Описанная выше техника клонирования пригодна и
для дрожжей. Аналогичные эксперименты становятся возможными и с клетками
высших животных и растений.
7.2.2. Гибридизация нуклеиновых кислот
Этот вопрос здесь детально не обсуждается, поскольку он уже
