Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Тёрнер Э. -> "Биосенсоры: основы и приложения" -> 56

Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.

Тёрнер Э., Карубе И., Уилсон Дж. Биосенсоры: основы и приложения — М.: Мир, 1992. — 614 c.
Скачать (прямая ссылка): biosensoriosnoviiprilojeniya1992.djvu
Предыдущая << 1 .. 50 51 52 53 54 55 < 56 > 57 58 59 60 61 62 .. 355 >> Следующая

обоих направлениях. Именно это является ключом для объяснения наблюдаемых
эффектов. Константы Михаэлиса и ингибирования для модифицированного
фермента примерно в 15-23, а числа оборотов в 12-30 раз выше, чем для
нативной формы. По-видимому, повышенная активность фермента при высокой
концентрации субстрата обусловлена увеличением скорости обратных реакций
для коферментов. При уменьшении концентрации нативный и модифицированный
ферменты по активности сближаются друг с другом.
Еще один пример модифицированного фермента с повышенной активностью-ди-
гидрофолатредуктаза из печени цыпленка, хотя на молекулярном уровне
причины такого изменения активности фермента непонятны. Многочисленные
реагенты, взаимодействующие с цистеином-11, вызывают 5-10-кратное
повышение активности фермента по отношению к физиологическим субстратам
NADPH и дигидрофолату ([2] и ссылки в статье). В данном случае, однако,
за улучшение приходится расплачиваться значительным понижением
термической устойчивости модифицированного фермента. В заключение
упомянем повышение АТРазной активности 14S и 30S динеина после
модификации аминогрупп тринитробензолсульфонатом [42].
8.3.2. Модификация, вызывающая изменение поверхностных свойств
Рассмотренные в предыдущем разделе примеры, хотя и интересны, а в
некоторых случаях поддаются объяснению post hoc, не относятся к числу
предсказанных наперед и мало полезны при попытке "конструировать" белок
определенным образом. Одно из направлений химической модификации, где
результат можно предсказать на основе некоторых данных о белке и физико-
химических соображений, заключается в изменении поверхностных свойств
молекулы. Простейшим с точки зрения и реализации, и интерпретации случаем
является изменение поверхностного заряда. На рис. 8.2 приведены типичные
реакции, используемые для удаления или обращения заряда. С помощью этих
реакций авторы [52] смещали значение рКа химотрипсина на +1 от исходного
значения, равного 7. Как и ожидалось, обращение положительного заряда в
отрицательный увеличивает рКа, тогда как замена отрицательного заряда
положительным-уменьшает. Сукцинилированный химотрипсин характеризуется
также повышенным значением /ска, и пониженным Км для гидролиза
сложноэфирных субст-
108
Глава 8
У
NHJ
Ангидрид янтарной, кислоты
у
ЫНСО(СНг)2фО'
>

>
СОСГ
сосг
Уксусный ангидрид
Метиламин/ CDI
Этилендиамин /CDI
У
У
У
CONHCH3
CONH(CH2)2NH3
NHCOCH3
Рис. 8.2. Некоторые типичные реакции, используемые для нейтрализации или
обращения заряда поверхностных амино- и карбоксильных групп белков. CDI-
водорастворимый карбодиимид.
ратов; у фермента, модифицированного этилендиамином, не обнаруживается
изменения /скат. В последнем случае Км сильно зависит от pH, в отличие от
нативного фермента, у которого такой зависимости не существует.
Ацетилирование трипсина также привело к повышению активности фермента,
несмотря на то, что в этом случае критическим процессом было О-
ацетилирование экспонируемого тирозинового остатка [48]. Причиной
повышения активности трипсина, по мнению авторов [48], является
увеличение скорости образования ацилфер-мента при гидролизе сложных
эфиров и амидов.
Иногда вместо добавления катионов в реакционную среду можно использовать
присоединение заряженных групп. Примером может служить пластоцианин.
Реакция этого медьсодержащего "голубого белка", переносчика электрона, с
Р700+ в хлоропласте обычно требует присутствия ионов магния,
"экранирующих" отрицательные заряды карбоксильных групп пластоцианина.
Авторы [5] смогли достичь того же эффекта и, кроме того, сдвинуть
потенциал средней точки выше + 40 мВ, модифицируя белок этилендиамином.
Даже если при химической модификации поверхностный заряд остается на
прежнем уровне, иногда все же можно достичь положительного эффекта.
Авторы [12] лизино-вые остатки нескольких белков (химотрипсин,
рибонуклеаза, лизоцим, а-лактальбу-мин, цитохром, карбоангидраза, бычий
сывороточный альбумин) превратили в гомо-аргининовые, обрабатывая белки
О-метилизомочевиной:
Известно, что объемистая гуанидиновая группа занимает гидрофобные области
белка с меньшей вероятностью, чем аминогруппа. Поэтому замена последней
группы на первую должна стабилизировать структуру белка. Данные о
скорости обмена тритием между белком и водой действительно согласуются с
предположением о менее гибкой структуре модифицированного белка.
NH
NH2-С-осн3
Белковая инженерия и ее приложения в биосенсорах
109
Значительное улучшение термической устойчивости термолизина было
достигнуто [51] путем ацетилирования шести-семи аминогрупп лизиновых
остатков длинноцепочечными жирными кислотами, содержащими различное число
эфирных групп (рис. 8.3). Гидрофобность модифицирующих групп убывает от V
к I. Белки, модифицированные группами I, имеют фактически нормальную
активность (> 90% активности нативного фермента) и повышенную термическую
стабильность; производные же V нерастворимы в воде.
Предыдущая << 1 .. 50 51 52 53 54 55 < 56 > 57 58 59 60 61 62 .. 355 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed