Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
рассматривался в гл. 5. Напомним только, что гибридизация позволяет
установить сходство двух фрагментов ДНК (блотинг по Саузерну [16]) или
фрагментов РНК и ДНК (но-зерн-блотинг [1]). Связь этого метода с
предметом обсуждения данной главы рассматривается ниже.
7.2.3. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
Определение нуклеотидной последовательности, или секвенирование ДНК,
стало возможным лишь в последние годы. К 1977 г. было разработано два
метода секвени-рования ДНК: химический метод Максима и Гилберта [12] и
метод Сэнгера [15],
I 'синая инженерия
95
основанный на ингибировании полимеразной реакции, что приводит к
прерыванию синтеза ДНК в определенных точках.
7.2.3.1. Метод Максама и Гилберта. В этом методе используют определенный
фрагмент ДНК, получаемый расщеплением ДНК рестрикционной эндонуклеазой.
На одном конце нуклеотидной цепи вводят метку 32Р. Далее исследуемый
фрагмент обрабатывают реагентами, которые модифицируют одно из четырех
имеющихся в ДНК оснований так, что с помощью некоторых химических
реагентов (табл. 7.1) его можно удалить. При этом цепь расщепляется на
фрагменты различной длины, меченные с одного конца. Длину этих вторичных
фрагментов определяют с помощью гель-электрофореза высокого разрешения.
Детально реакции, используемые для сек-венирования ДНК, описаны в табл.
7.1.
Таблица 7.1. Реагенты, используемые для секвенирования ДНК методом
Максама и Гилберта
Основание Реагент, модифицирующий основание Реагент, удаляющий
модифицированное основание Реагент, расщепляющий нуклеотидную цепь
Гуанин Диметилсульфат Пиперидин Пиперидин
Гуанин + аденин Кислота Катализируемое кислотой депуриниро-вание
"
Тимин + цитозин Г идразин Пиперидин "
Цитозин Гидразин + NaCl " "
Аденин + цитозин NaOH Пиперидин Пиперидин
7.2.3.2. Секвенирование ДНК по Сэнгеру. Это наиболее употребительный
метод секвенирования ДНК, поскольку по сравнению с химическим методом он
позволяет анализировать более крупные фрагменты ДНК с меньшей
вероятностью ошибки. Секвенируемую ДНК сначала клонируют в одноцепочечный
бактериофаговый вектор, который может функционировать в Е. coli. Чаще
всего используют фаг М13 и его производные [13]. Одноцепочечная ДНК
взаимодействует как субстрат с ДНК-поли-меразой, которая точно копирует
первую цепь. Однако если нормальный дезокси-нуклеозидфосфат заменить его
аналогом дидезоксинуклеозидфосфатом, то дальнейшее функционирование
полимеразы прекращается и рост синтезируемой цепи останавливается. Для
инициирования этого процесса используют химически синтезированный
универсальный нуклеотидный праймер. Реакцию проводят в присутствии
четырех аналогов dNTP, один из которых содержит метку 32Р. Исходно
имеется четыре реакционные смеси, в каждой из которых понижена
концентрация одного из аналогов меченого нуклеотида. Поэтому в результате
реакции получаются смеси меченных радионуклидами фрагментов ДНК, один
конец у которых одинаков, но при этом они имеют разную длину и разные
основания на другом конце. После инкубации ДНК в каждой смеси
превращается в одноцепочечную форму. Затем смеси подвергают электрофорезу
в полиакриламидном геле. Длину и последовательность фрагментов ДНК можно
считывать непосредственно с гелевого слоя. Этот метод позволяет
секвенировать в одной серии реакции от 250 до 500 пар оснований.
Полученные данные часто анализируют с помощью компьютера.
7.2.4. Сайт-специфический мутагенез
После определения нуклеотидной последовательности представляющей интерес
части ДНК с помощью разработанной сейчас специальной методики в нее можно
96
Г. шва 7
внести сайт-специфические изменения, что позволяет исследовать влияние
замены определенных аминокислот в белке, кодируемом ДНК [6, 18]. Эту
методику называют сайт-специфическим мутагенезом. Субстратом, как и в
предыдущем случае, служит одноцепочечная ДНК, а праймером - синтетический
олигонуклеотид, в котором изменена одна пара оснований и который,
следовательно, обладает специфическим мутагенным эффектом. Для получения
двухцепочечной ДНК используют ДНК-полимеразу. Полученную таким способом
молекулу (плазмиду) с двумя несколько отличающимися цепями трансфецируют
в бактерию-хозяина. В некоторых случаях мутантные клоны можно отобрать по
фенотипу, но обычно их выявляют по способности к гибридизации с
синтетическими олигонуклеотидами. Эта методика лежит в основе ДНК-
опосредо-ванной белковой инженерии; более подробно этот метод рассмотрен
в гл. 8.
Выше мы попытались дать краткий обзор некоторых методов генной инженерии,
которые могут быть использованы для разработки биосенсоров. Теперь
обсудим, каких преимуществ можно ожидать от использования данных методов.
7.3. Применение генной инженерии в сенсорной технологии
7.3.1. Увеличение выхода фермента
Одно из очевидных применений техники рекомбинантной ДНК касается случаев,
когда используемый в биосенсоре фермент имеется в малых количествах или
его трудно выделить. В нашей лаборатории столкнулись с такой проблемой,
