Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
наблюдающиеся изменения способности к связыванию АТР и катализу [56].
Введение различных аминокислотных остатков в фермент не обязательно
сопровождается потерей каталитической активности. Например, замещение
треонина-51 пролином приводит как к уменьшению Км, так и к увеличению
/скат, вследствие чего отношение /ска7/Км возрастает в 25 раз [57].
Пытаясь понять и предсказать эффекты, связанные с замещением аминокислот
в мутантных ферментах, необходимо различать прямое взаимодействие остатка
с субстратом и сопутствующие структурные изменения, влияющие на контакты
во всей молекуле. Именно к последнему случаю относится описанный выше
результат замещения треонинового остатка пролином. Один из подходов,
использованных для решения данной проблемы, заключается в изучении
двойных мутантов. Если влияние двух мутаций соответствует сумме их
индивидуальных вкладов, то роль аминокислотных остатков, вероятно, чисто
локальная. И наоборот, любые отклонения от аддитивности предполагают, что
роль исследуемых аминокислот шире. Авторы [8] назвали этот эффект
"сцеплением". Они показали, что повышение ферментативной активности в
случае замены треонина на пролин обусловлено изменением структуры,
улучшающим контакт гистидина-48 с АТР. Роль этого взаимодействия была
дополнительно проверена путем введения мутаций в позицию 48. При
замещении гистидина аспарагином получается фермент той же активности, что
и фермент "дикого типа". В то же время введение глутаминового остатка
дает значительно менее активный продукт [29]. Этот результат
свидетельствует о том, что гистидиновый остаток связан водородной связью
через азот и какое-либо электростатическое взаимодействие исключается.
Позже [17] был проведен тонкий структурный анализ мутантных ферментов,
полученных заменой треонина-51 на аланин, цистеин или пролин. Детальное
кинетическое исследование мутантов показало, что максимальная активность
каждого из них зависит от концентрации АТР. Как известно, в тирозил-тРНК-
синтетазах из разных
Белковая инженерия и ее приложения в биосенсорах
105
источников аминокислотные остатки в данной позиции различны. Видимо, в
ходе эволюции отбирались ферменты, имеющие максимальную активность при
определенной внутриклеточной концентрации АТР.
Недавно сравнение свойств ряда мутантных ферментов использовали [18] для
выяснения роли водородных связей в специфичности тирозил-тРНК-синтетазы.
Систематически варьируя аминокислотные остатки, авторы смогли установить
вклад водородных связей в связывание АТР и тирозина и специфичность
фермента к этим субстратам. Они заключили, что удаление остатка,
образующего водородную связь с незаряженной группой субстрата, приводит к
снижению энергии связывания последнего лишь на 2 6 кДж/моль; если же
водородная связь образуется с заряженной группой, наблюдается значительно
больший эффект, до 16 кДж/моль. В недавней работе [55] показано, что
водородные связи играют важную роль и в преимущественном связывании
субстрата в переходном, а не в основном состоянии.
Хотя в большинстве случаев мутации в этом ферменте подвергали активный
центр, изучалось также взаимодействие субъединиц фермента. Нативная
тирозил-тРНК-син-тетаза-это гомодимер, в котором экспонируется половина
реакционных центров. Судя по кристаллической структуре фермента, важную
роль в контакте его субъединиц играет фенилаланин-164. Если этот остаток
заменить аспартатом, то, согласно данным о стационарной кинетике,
титровании активного центра и равновесном связывании, при высоких pH и
низкой концентрации фермента в отсутствие тирозина или АТР как лигандов
димер диссоциирует [22]. Авторы полагают, что диссоциация индуцируется
именно ионизацией аспартата, тогда как лиганды заметно связываются лишь с
димером. тРНК не влияет на равновесие мономер/димер, что заставляет
предположить отсутствие предпочтительного связывания с любой формой.
Фермент |3-лактамаза катализирует гидролиз пенициллинов и служит основой
ряда сенсоров, чувствительных к р-лактамовым антибиотикам. Ген этого
фермента обычно служит маркером в векторе pBR322 [3]. В работе [13]
использовали дважды неспаренный олигонуклеотид для инвертирования
дипептида серин/треонин в активном центре фермента, что привело к потере
его активности. При замене в активном центре серина на цистеин мутантный
фермент еще проявляет активность, хотя и более низкую, чем нормальный
фермент, и чувствителен к ингибированию сульфгидрильными реагентами [45].
Однако тиоллактамаза имеет несколько лучшие свойства, чем нативный
фермент. Она более устойчива к трипсину и не ингибируется борной кислотой
[46].
Важной задачей белковой инженерии является увеличение температурной
устойчивости. Один из подходов к решению этой задачи - введение
внутримолекулярных сшивок. Его пытались использовать для
дигидрофолатредуктазы и Т4-лизоцима. Судя по предварительным результатам,
дисульфидные мостики в обоих этих белках могут подвергаться мутациям. В
