Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
После удаления нуклеиновых кислот в растворе могут остаться капсульные камедеподобные углеводы. Это создает трудности при использовании обычных методов осаждения белков. В присутствии этих веществ невозможно применение сульфата аммония и других методов фракционного осаждения. Лучше полностью осадить белок в надежде, что камедеподобные вещества останутся в растворе. Практически весь белок можно осадить при 80% -ном насыщении сульфатом аммония (разд. 3.3) или 55%-ной концентрации ацетона (разд. 3.4). В случае использования сульфата аммония для осаждения белка может понадобиться скоростное центрифугирование. Но даже после этого растворенный белковый осадок содержит вещества, снижающие воспроизводимость результатов при работе на колонке или при использовании других методов фракционирования.
Недавно найдены два пути преодоления этих трудностей. Первый путь — это «амфифильная» адсорбция на геле агарозы (разд. 4.8), при которой все белки адсорбируются на гранулах агарозы в растворе сульфата аммония 70—80%-ного насыщения, тогда как небелковый материал вымывается. При экстракции гранул агарозы буфером белок переходит в раствор, который далее фракционируют обычным способом. Второй путь — использование соответствующего метода экстракции. При обработке клеток лизоцимом обычно не образуется слишком много капсульных камедеподобных веществ — лизоцим растворяет их, но не разрушает все бактериальные клетки. Для получения до-
Приготовление экстракта
5!
статочно прозрачного экстракта из бактерий успешным оказалось использование лизоцима вместе с неионным детергентом [14]. После удаления нуклеиновых кислот такой экстракт можно непосредственно использовать для фракционирования. Подобные проблемы возникают при работе не со всеми бактериями. Опубликовано множество работ по выделению ферментов из бактериального материала, в которых успешно проводится обычное фракционирование вслед за обработкой экстрак-та протамином или стрептомицином.
Приготовление экстрактов из дрожжей связано с несколькими проблемами. Главная из них состоит в том, что клеточные стенки у грибов очень толстые и их трудно разрушить. Поэтому для получения экстракта требуются более эффективные методы. Если экстракт нужно получить быстро, единственный надежный способ — это применение вибрационной шаровой мельницы или гомогенизатора Мэнтона — Гаулина. При использовании этих методов образуется большое количество частиц низкой плотности, которые не полностью удаляются центрифугированием. Мутность может снизить эффективность осаждения белка сульфатом аммония. Однако ее можно устранить путем агрегации частиц в органическом растворителе (ацетон, 20— 25% по объему при 0°С). В прозрачном растворе остается большинство ферментов, которые осаждаются при повышении концентрации ацетона (разд. 3.4). Прозрачные экстракты получают также, используя автолиз толуолом, но в этих условиях может происходить протеолитическое расщепление белков.
Для выделения очень стабильного фермента фосфоглюкому-тазы применяют цитолиз под действием концентрированного аммиака [13]. Эта процедура разработана и широко применяется при работе с «активными сухими» дрожжами. Ее используют для получения прозрачных экстрактов, содержащих большую часть гликолитических ферментов [18]. Некоторые ферменты полностью разрушаются при высоких значениях pH. При использовании этого метода протеолиз не представляет серьезной проблемы, так как активность протеаз достаточно низка при pH 9,5—10. Эффективность экстракции может значительно варьировать в зависимости от партии дрожжей.
Теперь можно было бы перейти к обсуждению методов очистки; экстракт, содержащий значительную часть фермента, получен, из него удалены частицы и небелковый материал. Но перед тем, как закончить эту главу, следует остановиться на классе ферментов, который не затрагивался в предыдущих разделах. Это нерастворимые ферменты, ассоциированные с частицами. По определению, они отсутствуют в прозрачном экстракте.
4*
52
Глава 2
2.4. МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ОЧИСТКЕ ФЕРМЕНТОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ЧАСТИЦАМИ
В этом разделе кратко рассматриваются методы работы, используемые для выделения ферментов, структурно связанных с нерастворимыми компонентами клетки, такими, как митохондрии, хлоропласты, плазмалемма, эндоплазматический ретикулум и ядерные мембраны. Эти методы не применяются к водорастворимым ферментам, заключенным внутри органелл, например к белкам митохондриального матрикса, а лишь к ферментам, ковалентно связанным или прочно ассоциированным с частицами. Существенной степени очистки по сравнению с исходным материалом можно добиться, многократно промывая гомо-генат буфером, в котором данный фермент не растворяется. После этого возможны два подхода к решению проблемы. Можно фракционировать осадок методом дифференциального центрифугирования (седиментация или градиент плотности), с помощью электрофореза или «молекулярных сит».
Другой способ заключается в солюбилизации фермента (субфракционирование, конечно, может предшествовать солюбилизации). Не все ферменты способны существовать в солюбилизированном состоянии, будучи изолированы от их нормального клеточного окружения; поэтому успех очистки таких ферментов зависит от того, насколько полно можно отделить фрагменты частиц, содержащие фермент, от прочего корпускулярного материала.
