Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
дрожжей) необходимо специально выращивать в определенных условиях и в довольно больших количествах. Для каждой из таких групп микроорганизмов, как водоросли, грибы, дрожжи и бактерии, требуются особые условия выращивания, сбора клеток и экстрагирования. Особой проблемой, требующей тщательного изучения, является значительное изменение ферментного состава в различные фазы роста клеток. Желательно производить сбор бактериальных клеток и других одноклеточных микроорганизмов в течение логарифмической фазы роста (рис. 2.1), хотя активность изучаемого фермента может и не быть максимальной в этот период. Следует проводить предварительные исследования организма с целью определения физиологического состояния, при котором содержание нужного фермента наибольшее.
Saccharomyces cerevisiae, пекарские дрожжи, доступны в больших количествах, так что если их можно использовать, то проблема сырья решена. Прессованные дрожжи, поступающие в продажу, в конце фазы роста состоят практически на 100% из дрожжевых клеток. Выращивание дрожжей производят на различных питательных веществах. Основным источником углерода для них служит меласса или какой-либо другой источник сахарозы. При 0°С дрожжи остаются жизнеспособными (и, следовательно, ферменты сохраняют активность) в течение нескольких недель, а при хранении в замороженном виде их можно использовать и через несколько месяцев. В хлебопекарной промышленности и у биохимиков большой популярностью пользуются сухие дрожжи, жизнеспособность которых восстанавли-
Приготовление экстракта
37
вается при добавлении к ним воды. Они служат очень удобным источником многих ферментов, хотя в процессе сушки активность некоторых, наиболее чувствительных, ферментов может несколько снижаться. При хранении в вакууме или в атмосфере азота при 0—4 °С их можно использовать даже через несколько лет. Дрожжи — это, пожалуй, наиболее удобное сырье, при условии что удается разрушить клетки (см. ниже).
Истинный энзимолог редко интересуется проблемой сырья; единственное, что ему нужно, — это выделить как можно больше фермента из наиболее удобного источника. В этом случае необходимо изучить литературу и выбрать лучший объект, с которым можно работать. При сравнении результатов, полученных в разных лабораториях, порой стоит самому провести несколько экспериментальных измерений. Очень важно убедиться в том, что фермент, присутствующий в исходном материале, экстрагируется из него полностью, для того чтобы можно было достоверно определить его содержание в ткани. При неполном разрушении клеток можно недооценить данный объект как источник ферментов из-за того, что значительная часть ферментативной активности не выходит в раствор, а удаляется вместе с осадком во время получения экстракта. Если фермент выделяют из бактериального материала, то экспериментатор должен учитывать возможность отбора штаммов с аномально высоким уровнем ферментативной активности. Это можно сделать либо путем обычного отбора мутантов, либо используя более сложную технику клонирования, посредством которой множественные копии гена фермента включаются в бактериальный геном с помощью плазмид [1]. Экспрессия гена может быть еще более усилена за счет его слияния с сильным промотором [2]. Эта работа занимает много времени, и выполнить ее может только опытный специалист; не стоит даже пытаться применять эти методы, если на выделение фермента отведено мало времени.
Свежесть сырья и его хранение
Обычно чем быстрее используется сырье, тем лучше, т. е. препарат получается более соответствующим нормальному физиологическому состоянию, так как, если ткань некоторое время была «мертва», начинаются естественные процессы разложения. Однако бывают случаи, когда абсолютная свежесть может быть помехой. Например, в скелетных мышцах содержится большое количество АТР. В присутствии фосфокреатина и гликогена высокая концентрация АТР сохраняется в течение нескольких часов и после смерти. Структурные белки миозин и актин в норме нерастворимы при ионной силе ниже 0,25, но в присутст-
38
Глава 2
вии ATP разорванные миофибриллы набухают и часть белков переходит в раствор. Даже при физиологической ионной силе (— 0,16) некоторое количество миозина может перейти в растворимое состояние. Впоследствии это может сказаться на качестве ферментных препаратов, так как миозин осаждается и смешивается с фракциями, в которых он не должен присутствовать. Примером особого рода служит получение препарата АМР-дезаминазы [3J. При экстракции совсем свежих мышц буфером с рекомендуемой ионной силой 0,25 в раствор переходит много актина и миозина, что мешает следующему этапу — адсорбции на фосфоцеллюлозе. Препарат лучшего качества можно получить, если мышцам сначала дать возможность перейти в состояние окоченения, что сопровождается потерей АТР. Однако это редко встречающийся случай. Обычно все же следует работать на свежем материале.
Возможность получить свежий материал не всегда совпадает с возможностью использовать его. Как полученный материал, так и экстракт из него следует хранить замороженными. В процессе замораживания происходит множество событий. Прежде всего замерзает свободная вода и образуются кристаллы льда. Кристаллы льда разрушают мембраны и органеллы, но не повреждают непосредственно ферменты. По мере приближения температуры к точке эвтектики для различных солей, присутствующих в растворе, эти соли кристаллизуются. Наименее растворимая соль из пары, входящей в состав буфера, первой выпадает из раствора, вследствие чего значение pH может значительно измениться еще до того, как раствор полностью замерзает [4, 5]. Если хранение происходит при температуре от —15 до —25 °С (обычная температура для испарителей в бытовых холодильниках и простых морозильников), то значение pH оставшегося незамороженным концентрированного раствора будет отличаться от значения pH исходного раствора. В таком концентрированном белковом растворе протеазы, освободившиеся из лизосом в процессе замораживания, могут начать функционировать (хотя и медленно при такой низкой температуре), и хранение материала в течение нескольких недель может сильно ухудшить его качество. Таким образом, при замораживании следует очень быстро снижать температуру до —25 °С и хранить материал, если возможно, даже при более низкой температуре. Коммерческие морозильники дают температуру до —80 °С.
