Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Избыток детергента может мешать фракционированию. Например, высаливание сульфатом аммония приводит к появлению на поверхности раствора слоя тритона X-100, в котором часто содержатся нужные белки. Однако эффективного разделения при этом не происходит. Можно провести колоночную хроматографию или отделить белки с помощью гель-фильтрации (разд. 5.1), но не исключено, что мицеллы детергента будут двигаться в той же зоне, что и белок, и, следовательно, окажутся в одной фракции. Ионообменная хроматография успешно осуществляется в присутствии неионных детергентов (разд. 4.2 и 4.3). Действительно, тритон Х-100 в концентрации до 1% оказывает незначительное влияние на ионообменные свойства нормальных водорастворимых белков. Но солюбилизированные белки мембран могут находиться только в составе детергентных мицелл, что существенно влияет на процесс ионного обмена. Если исследуемый белок удается адсорбировать на ионообменнике, то избыток детергента свободно проходит через колонку. Это позволяет элюировать свободный (относительно) от детергента белок. С другой стороны, если полное удаление детергента приводит к денатурации белка, то, чтобы предотвратить это, в буфер вносят небольшое количество детергента (<0,1 %). Собранная фракция будет, конечно, тоже содержать некоторое количество детергента. Тем не менее, так как обычно из смеси белков выделяют какой-то определенный фермент, присутствие в конечном препарате незначительной концентрации чистого детергента, не загрязненного жирами, не принесет большого вреда. Методы удаления избытка детергентов были недавно суммированы в обзоре [23].
Исчерпывающее обсуждение методов экстракции водорастворимых ферментов из мембран читатель найдет в другой работе [19]. Белки, связанные с мембранами, очевидно, отличаются по растворимости от типичных цитоплазматических ферментов, и для их очистки иногда применяются (и вполне успешно) некоторые необычные эмпирически найденные методы.
ГЛАВА 3
РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПУТЕМ ОСАЖДЕНИЯ
3.1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
На ранних этапах становления белковой химии единственным применяемым на практике способом разделения белков различных типов было осаждение части белковой смеси за счет изменения некоторых свойств растворителя. Далее осадки отфильтровывали и растворяли в исходном растворителе. И до сих пор эти процедуры .занимают важное место в процессе очистки белков, однако теперь в большинстве случаев фильтрация заменяется центрифугированием. Белковые осадки представляют собой достаточно крупные агрегаты белковых молекул, так что их можно отцентрифугировать при относительно низкой центробежной силе. В некоторых случаях агрегация идет дальше и осадок флоккулирует, тем не менее размеры агрегатов обычно остаются небольшими вследствие движений и столкновений частиц суспензии. Это приводит к засорению бумажных фильтров, и возникает необходимость в центрифугировании при существенно более высоких ускорениях чем 1 g. Различные способы получения осадка описаны ниже в отдельном разделе.
Первоначально белки классифицировали в зависимости от их растворимости, и, хотя сейчас эта классификация в основном уже забыта, соответствующие названия до сих пор используют, когда речь идет о сывороточном альбумине или иммуноглобулинах. Глобулинами называли белки, нерастворимые при низких концентрациях соли в растворе; сывороточные глобулины можно осадить, просто разводя сыворотку водой, при этом альбумины остаются в растворе. Поведение глобулинов — пример изоэлектрического осаждения белков в области «всалива-ния» (разд. 3.2). Однако эта классификация порождает путаницу, так как некоторые белки нерастворимы при pH 6, на растворимы при pH 8 и более низкой концентрации соли. Тем не менее существуют белки, которые по своим свойствам полностью соответствуют глобулинам. Это обычно белки с низкой растворимостью в водной среде, несущие на своей поверхности значительное число гидрофобных аминокислотных остатков. И наоборот, есть много истинных альбуминов, хорошо растворимых в воде и характеризующихся низкой гидрофобностью.
Разделение белков путем осаждения
57
Рис. 3.1. Распределение зарядов и гидрофобных областей на поверхности молекулы типичного белка.
Распределение гидрофильных и гидрофобных остатков на поверхности белковой молекулы является признаком, определяющим растворимость белка в различных растворителях. Хотя гидрофобные группы стремятся сконцентрироваться внутри белковой молекулы, значительная их часть располагается на поверхности и контактирует с растворителем (рис. 3.1). Гидрофобным группам на поверхности молекул наряду с заряженными и другими полярными группами принадлежит важная роль в определении поведения белков. Основным компонентом растворителей всегда является вода, хотя есть основания предполагать, что, например, интегральные мембранные белки можно было бы выделять, используя неводные растворители. Для изменения растворимости белка можно манипулировать свойствами воды как растворителя, изменяя ионную силу, pH, количество добавляемых, смешивающихся с зодой, органических растворителей и других инертных веществ или полимеров, а также комбинируя эти изменения с изменениями- температуры. Чаще всего для селективного осаждения белков используют нейтральные соли. Это и будет предметом обсуждения двух следующих разделов.
