Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 18

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 12 13 14 15 16 17 < 18 > 19 20 21 22 23 24 .. 145 >> Следующая

После разрушения клеток в соответствующем буфере желательно проверить pH гомогената. Хотя после гомогенизации действительно свежего материала в буфере гомогенат имеет тот же pH, что и буфер, это значение может снизиться вследствие метаболических процессов, ведущих к закислению среды. Хорошим примером могут служить скелетные мышцы, в которых гликоген быстро превращается в молочную кислоту, и pH гомогената может упасть с 7,0 до 6,0 за 30—60 мин (включая время центрифугирования). В таких случаях перед центрифугированием значение pH можно поднять выше нужной величины (например, 1 М трис-буфером). Кроме того, добавление ингибитора гликолиза может остановить процесс. Для этой цели иногда используют фторид (10—30 мМ).
Эти общие замечания относятся к улучшению условий экстракции всех растворимых компонентов. При экстрагировании какого-то одного фермента лучше использовать другие условия, лри которых не происходит полной солюбилизации всех компонентов, тогда как нужный фермент экстрагируется полностью.
Часто экстракт получается мутным. После центрифугирования на его поверхности могут плавать частицы жира. Жир можно удалить грубой фильтрацией через стекловату или плотную фильтровальную ткань. Нерастворимые частицы суспензии содержат органеллы и фрагменты мембран, которые полностью осаждаются только при 100000g— процедура очень неудобная для больших объемов экстракта. Фильтрация в таких случаях обычно бесполезна, так как если фильтр достаточно плотен и задерживает частицы, то он быстро засоряется. Однако, если
Приготовление экстракта
49
мутность незначительна, но нужен прозрачный экстракт — например, для пропускания через адсорбционную колонку, — фильтрацию можно провести с помощью целита (разд. 1.2).
Теперь рассмотрим различные типы экстрактов. При работе с некоторыми животными тканями частицы составляют незначительную часть экстракта и ими можно пренебречь. Они агрегируют, скажем, при первом же фракционировании сульфатом аммония и затем удаляются. С другой стороны, есть животные ткани, содержащие больше жиров и мембранных структур; при экстрагировании таких тканей образуются суспензии. Подкис-ление среды до pH 6,0—5,0 обычно приводит к агрегации материала, который можно затем отцентрифугировать при относительно низкой скорости. Рибосомы и другие нуклеопротеиды обычно удаляются при подкислении, которое можно рассматривать как одну из форм изоэлектрического осаждения (разд. 3.2); фосфатные группы протонируются и нейтрализуют или по крайней мере снижают заряд частиц суспензии. Этот способ дает очень хорошие результаты при условии, что нужный фермент г) не осаждается изоэлектрически при данном значении pH, б) не адсорбируется на образовавшемся осадке или в) остается стабильным при нефизиологических значениях pH. Экстракт охлаждают и снижают pH соответствующей кислотой (например, 1 М уксусной, разд. 6.1). После перемешивания в течение 10—20 мин осадок отделяют центрифугированием, а pH надо-садочной жидкости доводят, если необходимо, до нужного значения перед тем, как приступить к первому этапу фракционирования. Растительные ткани отличаются прежде всего тем, что реакция среды в них более кислая и содержащиеся в них частицы, такие, как фрагменты хлоропластов, агрегируют значительно труднее. К тому же растительные экстракты содержат сравнительно мало корпускулярного материала, если не считать грубых частиц типа зерен крахмала, которые легко осаждаются после приготовления экстракта.
. При приготовлении экстрактов из микроорганизмов возникает целый ряд проблем. Во-первых, из быстропролиферирую-щих клеток экстрагируется много нуклеиновых кислот. Во-вторых, в процессе разрушения клеток материал клеточной стенки либо сильно диспергируется, в результате чего раствор становится мутным, либо частично растворяется, так что в растворе наряду с белками и нуклеиновыми кислотами оказывается много камедеподобных полисахаридов. Это создает определенные трудности на первых этапах фракционирования.
Экстракты, приготовленные из бактериального материала при помощи пресса Френча, под воздействием ультразвука или при обработке лизоцимом, получаются вязкими из-за присутствия в них ДНК и содержат значительные количества рибосом-
4—1078
50
Глава 2
ного материала. Все нуклеиновые кислоты осаждаются в результате их агрегации с макромолекулярными поликатионами. Хорошими реагентами для этого служат протамин лососевых рыб и клупеин молок сельди, поскольку связывание с ДНК — естественная функция этих веществ. С обычно используемым протаминсульфатом следует быть весьма осторожным: он обладает сильными кислотными свойствами, и перед употреблением его необходимо растворить в воде и нейтрализовать. Следует установить, какое количество протаминсульфата потребуется; оно может достигать 5 мг на 1 г обрабатываемого материала. Протаминсульфат осаждает ДНК, рибосомные нуклеиновые кислоты, мРНК, тРНК и другие нуклеиновые кислоты. На образовавшемся осадке могут также адсорбироваться некоторые белки. Адсорбцию на протаминовом осадке используют даже как этап в процессе очистки ферментов [16, 17]. Если применение протамина окажется невозможным или нежелательным, вязкость раствора ДНК можно снизить, используя при получении экстракта ДНКазу. Рибосомы можно осаждать стрептомицином. Хотя стрептомицин хуже осаждает нуклеиновые кислоты, чем протамин, при его использовании теряется меньше белка в результате адсорбции на образующемся осадке.
Предыдущая << 1 .. 12 13 14 15 16 17 < 18 > 19 20 21 22 23 24 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed