Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 25

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 19 20 21 22 23 24 < 25 > 26 27 28 29 30 31 .. 145 >> Следующая

66
Глава 3
Практические соображения о фракционировании белков путем высаливания
Высаливание белков связано с растворением солей в растворе, содержащем белки. Следует рассмотреть некоторые особенности этого процесса. Очень важна природа соли. Помимо ее эффективности в смысле осаждения белков необходимо учитывать такие физические характеристики соли, как растворимость. Наиболее эффективные соли — это те соли, анионы которых имеют большой заряд (например, сульфат, фосфат и цитрат)* Катионы в' этом отношении сравнительно менее важны. По способности к высаливанию анионы располагаются в ряд Гофмейстера, который для некоторых обычных анионов выглядит следующим образом: SCN~, 1~, СЮ4-, N03“ Вг“, С1“ СН3СОО“, S042", Р043-. Хотя, судя по положению в этом ряду, фосфат более эффективен, чем сульфат, на практике при нейтральном значении pH фосфат состоит из смеси ионов НР042” и Н2Р04"\ которые менее эффективны, чем РС>43“ Что касается эффективности действия катионов на осаждение белков, то моновалентные ионы можно расположить в следующий ряд: NH4+>K+> >,Na+. Из обычных недорогих солей эффективными осадителя-ми белков являются сульфаты, фосфаты и цитраты натрия, калия и аммония.
При выборе соли необходимо учитывать стоимость килограммовых количеств достаточно чистого препарата, растворимость (нужны растворы высокой концентрации), а также особенности, связанные с нагреванием раствора. Нежелательно нагревать раствор во время растворения соли. Кроме того, большая величина АН0 раствора свидетельствует о значительных изменениях растворимости в зависимости от температуры. Наконец, важное значение имеет плотность концентрированного раствора, так как эффективность центрифугирования при отделении осадка определяется разностью между плотностью белкового осадка и плотностью растворителя.
Соли калия в большинстве своем не подчиняются общим правилам растворимости, хотя фосфаты калия можно вполне использовать. Цитрат натрия очень хорошо растворим, но редко дает какие-либо преимущества при осаждении белков, за исключением того, что его можно использовать при pH выше 8. Что же касается солей аммония, то с ними невозможно работать при высоких значениях pH вследствие их буферного действия. По той же причине цитрат нельзя эффективно использовать при pH ниже 7. Сульфат натрия образует несколько гидратов и имеет сложную фазовую диаграмму растворимости. При низкой температуре его растворимость невысока. Он был использован для очистки яичного альбумина, причем температуру
Разделение белков путем осаждения
67
поддерживали около 30 °С, чтобы соль имела достаточную растворимость. Только одна соль обладает всеми преимуществами и не имеет недостатков при работе с типичным белком — это сульфат аммония. Исключение составляют те случаи, когда нужно работать при высоких значениях pH.
Растворимость сульфата аммония очень мало меняется в •области температур от 0 до 30°С; концентрация насыщенного раствора в воде составляет приблизительно 4 М. Плотность этого насыщенного раствора равна 1,235 г-см-3, а плотность белкового агрегата в таком растворе—1,29 г-см-3 (разд. 1.2). Раствор 3 М фосфата калия при pH 7,4 имеет плотность 1,33 г-см-3. Так как белковый осадок в этом растворе обладает такой же плотностью, его невозможно отделить центрифугированием. Однако отделение осадка можно осуществить с помощью фильтрации или же путем адсорбции на амфифильном носителе, например агарозе (разд. 4.8). Осаждение белков 3—4 М сульфатом аммония иногда также может быть затруднено из-за избыточной плотности, создаваемой присутствием в грубых экстрактах других солей и компонентов.
Сульфат аммония доступен в достаточно чистом виде и довольно дешев даже при использовании его в больших количествах. Однако незначительное загрязнение тяжелыми металлами, особенно железом, может повредить чувствительные к ним •ферменты. Перед осаждением белков солями аммония необходимо добавить в раствор какие-либо металлсвязывающие агенты, например ЭДТА. Важно отметить, что даже в том случае, когда содержание тяжелого металла в препарате соли составляет всего лишь одну часть на миллион, концентрация его биохимически активной формы в 3 М растворе сульфата аммония ¦будет равна нескольким мкМ. Количество сульфата аммония, которое нужно добавить для получения необходимой концентрации, можно подсчитать с помощью простой формулы (уравнение 3.5а). Эта формула учитывает увеличение объема при добавлении соли. Так, хотя растворимость сульфата аммония составляет 533 г-л-1 при 20°С, для получения насыщенного раствора к 1 л нужно добавить 761 г соли. Объем такого раствора будет равен 1,425 л, а его плотность составит 1761/1425=1,235 г-см-3. Концентрацию сульфата аммония
обычно выражают в процентах насыщения, допуская, что обрабатываемый раствор эквивалентен воде по способности растворять сульфат аммония. Для этого используют уравнение (3.56).
Количество сульфата аммония в граммах, которое нужно добавить к 1 л раствора при 20 °С, чтобы из раствора с моляр-ностью Mi получить раствор с молярностью М2, равно
Предыдущая << 1 .. 19 20 21 22 23 24 < 25 > 26 27 28 29 30 31 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed