Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Агрегацию гидрофобных участков на поверхности белка при высокой концентрации соли можно описать иными словами: по мере того как происходит сольватация ионов соли и свободных молекул воды остается мало, возрастает тенденция к отрыву упорядоченных «замороженных» молекул воды от гидрофобных боковых цепей с обнажением неполярных участков, которые стремятся взаимодействовать друг с другом. Белки, содержащие на поверхности молекул большое число или скопления гидрофобных аминокислотных остатков, агрегируют быстрее, тогда как белки с незначительным содержанием неполярных остатков на поверхности остаются в растворе даже при самых высоких концентрациях соли. Существуют и другие, более сложные интерпретации действия соли на растворимость белка, оперирующие понятиями свободной энергии. Эффективность действия различных солей коррелирует также с увеличением молярного поверхностного натяжения за счет соли, содержащейся в растворителе [26].
При высаливании исходной смеси белков происходит обильное выпадение в осадок соосажденных белков. Идентичные молекулы не стремятся отыскать друг друга, если поблизости есть другие «клейкие» молекулы. Тем не менее многие ферменты, осаждаются из раствора в достаточно узкой области концентрации соли, что делает эту процедуру высокоэффективным методом фракционирования. На рис. 3.6 и 3.7 показана зависимость растворимости некоторых ферментов от присутствия в растворе других белков. Растворимость чистого белка эмпирически описывается формулой
log (растворимость) — А—пг- (концентрация соли), (3.4)-
где А — константа, зависящая от температуры и pH, a m — константа, не зависящая от температуры и pH. Значения этих величин для нескольких чистых белков даны в табл. 3.1. Для смеси белков это уравнение не подходит, так как степень со-осаждения зависит от свойств других белков, присутствующих:
50 60 70 Степень насыщения, %
2,0 2,4 2,8 М
Рис. 3.6. Растворимость альдолазы из мышц кролика в растворе сульфата аммония при pH 7,0. Светлыми кружками обозначена растворимость чистого фермента: lg (растворимости) =6,30—2,84Х (конц. соли). Черные кружки означают растворимость смеси ферментов из мышц кролика — альдолазы, пируваткиназы, глицеральдегидфосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в соотношении 3:3:3: 1. (Неопубликованные результаты автора.)
2,0 2,4 2,8 М
Рис. 3.7. То же, что и на рис. 3.6, но в данном случае Оыла использована пируваткиназа. Светлые кружки — растворимость чистого фермента: Hg (раств.) = 10,2—4,34Х(конц. соли); черные кружки —смесь ферментов. (Неопубликованные результаты автора.)
Разделение белков путем осаждения
65
Таблица 3.1. Некоторые значения констант А и т в уравнении (3.4) для очищенных ферментов при pH 7,01J
Белок Л т Концентра
ция сульфа
та аммония
при раство
римости,
равной
1 мг-мл-1, М
Альдолаза из мышц кролика 6,30 2,84 2,20
Пируваткиназа из мышц кролика 10,2 4,34 2,34
Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа из мышц 8,6 2,48 3,34
кролика
Лактатдегидрогеназа из мышц кролика 8,0 3,97 2,02
Фосфоглицератмутаза из мышц кролика 9,85 4,26 2,32
Бычии сывороточный альбумин 9,2 3,26 2,84
') Растворимость выражена в мг-мл-1.
Источник данных: неопубликованные наблюдения автора.
в растворе. Как правило, растворимость определенного компонента снижается в присутствии других белков.
Хотя высаливание в значительной мере определяется гидрофобными взаимодействиями, другие параметры также влияют на растворимость белков. Так, растворимость может изменяться при изменении pH; потеря заряда снижает полярность поверхности белка. Обычно самую высокую растворимость в солевых растворах белки имеют при pH 7, когда они содержат наибольшее число заряженных групп. С другой стороны, агрегация происходит легче вблизи изоэлектрической точки белка. Классический пример такой агрегации представляет одностадийная очистка глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.12) из мышц кролика [27]. При pH 6 этот фермент растворим в 3,2 М сульфате аммония, но выпадает в осадок при pH 7,5 или выше, причем он может быть получен в кристаллическом виде даже из грубого экстракта. Его изоэлектрическая точка (по крайней мере при низкой концентрации соли) лежит при pH около 8,5.
Температура оказывает необычное действие на растворимость белков при высокой концентрации соли из-за того, что, как было сказано выше, она влияет на гидрофобные взаимодействия. В области высаливания растворимость белков обычно снижается с повышением температуры. Мутный белковый раствор, приготовленный для кристаллизации при комнатной температуре (разд. 9.3), часто становится абсолютно прозрачным при температуре 4°С.
