Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
3.2. РАСТВОРИМОСТЬ БЕЛКОВ ПРИ НИЗКОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ СОЛЕЙ
Большая часть ферментов находится в клеточной жидкости в виде растворимых белков, причем часто их содержание в концентрированной смеси может достигать 40% [24]. Таким образом, они хорошо растворимы при физиологических концентрациях солей, ионной силе около 0,15—0,2 М и нейтральном значении pH. В процессе экстракции эти условия могут легко меняться, хотя повышение концентрации белка (путем удале-
58
Глава 3
— (Слабое притяжение в
~_~у изоэлектрической
+ S точке
/— г ^ слабое рис 3 2 Электростатические
^с//^междуА взаимодействия между молекула-
(^Г + гетерогенными ми белка и небольшими агрегата-
^----^ агрегатами ми молекул.
ния растворителя) или значительное снижение ионной силы (путем удаления низкомолекулярных ионов) связано с определенными неудобствами. Растворимость можно рассматривать как результат полярного взаимодействия растворенного вещества с водным растворителем и ионных взаимодействий его с присутствующими солями, а также в некоторой степени как результат электростатических сил отталкивания между одноименно заряженными молекулами или небольшими (растворимыми) агрегатами молекул. В небольших агрегатах сильные разноименные заряды взаимопогашаются (рис. 3.2). Некоторые белки образуют осадок при ионной силе от нуля до физиологического значения вследствие того, что силы отталкивания между молекулами недостаточны. Например, если поверхность глобулы характеризуется высокой гидрофобностью, то это значит, что лишь малая ее часть взаимодействует с растворителем и соответственно меньшее число заряженных групп реагирует с солями. Если заряд снижается до нуля, электростатическое отталкивание уменьшается и по мере приближения к изоэлектри-ческой точке молекулы притягиваются друг к другу (рис. 3.3). Этот процесс называется изоэлектрическим осаждением: растворимость белка типа глобулина минимальна при значении pH, близком к его изоэлектрической точке, которая может быть достаточно низка, чтобы привести к осаждению белка. В смеси белков ситуация осложняется соосаждением: разные белки со
Разделение белков путем осаждения
59
Рис. 3.3. Растворимость белка, обладающего свойствами глобулина, при значениях pH, близких к изоэлектрической точке (ИЭТ).
сходными свойствами агрегируют и осаждаются при достиже-нии изоэлектрической точки. Во многих случаях такие осадки образуются в тканевом экстракте при понижении pH до значений от 6,0 до 5,0. При этом агрегируют не только растворимые белки, но и частицы, например рибосомы и фрагменты мембран, о чем говорилось выше (разд. 2.3).
Растворимость белков типа глобулинов уменьшается по мере снижения концентрации соли. Это свойство редко используется при работе с грубым экстрактом, так как двукратного снижения концентрации соли можно легко добиться только при добавлении равного объема воды. Если же растворимость не удается снизить более, чем в два раза, никакого осадка не образуется. Однако это свойство может быть полезным (хотя иногда и создает неудобства) на дальнейших этапах очистки, когда обессоливание проводят посредством диализа или гель-фильтрации. При диализе против буфера с низкой ионной силой в диализном мешке может образоваться осадок. Если этот осадок содержит большую ,часть нужного фермента или, наоборот, не содержит его, то достигается определенная степень очистки. Осадок отделяют центрифугированием. Однако в процессе гель-фильтрации могут возникнуть неприятности из-за изоэлектри-ческого осаждения белка в колонке. Агрегаты могут забить ко-
60
Глава 3
Рис. 3.4. Растворимость белка, являющегося глобулином, при определенном значении pH, близком к изоэлектрической точке (ИЭТ), и различных концентрациях соли.
Концентрация соли
лонку, или, осаждаясь и связываясь с адсорбентом, они удерживаются в колонке до тех пор, пока вновь не произойдет растворение осадка за счет солей, удаленных из исходного белкового раствора. В этих условиях обессоливание методом гель-фильтрации может вовсе не происходить (разд. 1.4).
Изоэлектрическое осаждение белков с низкой растворимостью можно усилить введением в раствор вещества, снижающего растворимость белка. Осадок можно получить, добавляя в раствор органические растворители или полиэтиленгликоль и одновременно изменяя значение pH (разд. 3.4 и 3.5). Примером использования такого метода служит очистка фосфофруктоки-назы дрожжей [17].
Увеличение растворимости белка (при данных pH и температуре) с повышением концентрации соли известно как «всали-вание». При очистке ферментов чаще используется обратный процесс, осуществляемый путем разведения и диализа. Типичная кривая «всаливания» чистого белка дана на рис. 3.4. Чтобы при разбавлении раствора могло произойти осаждение белка, кривая зависимости растворимости от концентрации соли должна иметь достаточную крутизну.
Практические рекомендации
Большая часть осадков, полученных изоэлектрическим осаждением, представляет собой агрегаты разных белков, в состав которых могут входить фрагменты органелл и комплексы белков с нуклеиновыми кислотами. Если исходный состав раствора меняется, выделяемый фермент в отсутствие его партнеров по осаждению будет иметь уже другую растворимость. Изоэлектрическое осаждение обычно происходит при значениях pH ниже физиологического. Поэтому следует убедиться, что фер-
