Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
44
Г лава 2
цы. Мутность полученного раствора не имеет существенного значения, так как ее можно устранить на этапах фракционирования. Использование более мощных устройств для разрушения клеток, таких, как шаровая мельница, дает возможность разрушать клеточные стенки до мельчайших частиц относительно низкой плотности, обусловленной тем, что в них обычно содержатся липиды. Такие частицы трудно осаждаются при доступных для больших объемов величинах g, и экстракт может остаться очень мутным. Методы осветления экстракта описаны ниже'(разд. 2.3).
Далее в общих чертах описываются процедуры получения экстрактов из различных тканей.
Ткани животных
Ткань разрезают на кусочки, удаляют, насколько это возможно, соединительную ткань и жир. Разрезанную ткань помещают в лопастной гомогенизатор, добавляют 2—3 объема холодного экстрагирующего буфера в расчете на 1 г ткани. Смесь гомогенизируют в течение 30 с; гомогенизацию повторяют, если остались куски неразрушенной ткани. При доведении pH до нужного значения перемешивают гомогенат 110—15 мин, а затем переносят его в центрифужные пробирки. Центрифугируют при 5000—10000^ в течение 60 мин (2*105—3-105g-мин). Экстракт сливают через фильтр «Miracloth» (Chicopee Mills, Inc., N. J.), марлю или стеклянную вату для удаления частиц жира.
Эритроциты
Экстракт можно легко получить из осажденных центрифугированием эритроцитов после промывания их изотоническим раствором NaCl (0,9%, 0,15 М) и повторного центрифугирования. Клетки разрушают осмотическим шоком в воде (2 объема воды на 1 объем отцентрифугированных клеток). Однако около 90% белка, переходящего в раствор, составляет гемоглобин, и если вы занимаетесь очисткой другого белка, то очень полезно применить метод селективного удаления гемоглобина. Для денатурации гемоглобина успешно применяется смесь этанол— хлороформ [7].
Мягкие растительные ткани
К растительной ткани добавляют только 0,5—1 объем холодного буфера, содержащего 20—30 шМ меркаптоэтанола и гомогенизируют в течение 30 с. Вместо этого можно пропустить
Приготовление экстракта
45
материал через бытовую соковыжималку, предварительно промытую буфером. Гомогенат следует отдентрифугировать как можно скорее, чтобы уменьшить его потемнение в результате окисления (2-105—3-105g-мин). Жидкость осторожно сливают с поверхности осадка. Для адсорбции фенолов полезно добавить порошкообразный поливинилпирролидон.
Дрожжи
L Полностью разрушить клетки можно с помощью гомогенизатора Мэнтона—Гаулина (Gaulin Corp. Mass.) или мельницы «Vibrogen Cell Mill» (Biihler, Tubingen), используя около двух объемов буфера на 1 г сырой массы.
2. Автолиз толуолом. Применяют различные методы с использованием толуола [8—110]; однако не все они пригодны для работы с коммерческими дрожжами. В основе этих методов лежит обработка дрожжей толуолом, обычно при температуре 35—40 °С. Через 20—30 мин дрожжи «разжижаются» вследствие экстракции компонентов клеточной стенки. После этого к дрожжам добавляют буфер и перемешивают их в течение нескольких часов или оставляют на ночь на холоде. Так как метод автолитический и структуры клеточной стенки разрушаются под действием ферментов, во время обработки может произойти деградация некоторых клеточных ферментов. Вместо толуола можно использовать этилацетат [11, 12], но он не годится для работы со штаммами дрожжей, имеющими более прочные клеточные стенки.
3. Цитолиз аммиаком [13]. Этот метод более всего подходит для работы с сухими дрожжами; он прост, но некоторые ферменты, не обладающие устойчивостью при pH 10, могут быть полностью утрачены. «Активные сухие» дрожжи размешивают в 0,5 М растворе NH4OH (2 объема раствора на 1 г сухого веса) в течение 16—20 ч при комнатной температуре. Введение небольшого количества толуола (5—10% от общего объема) иногда способствует растворению белков. Затем добавляют 1^-2 объема воды и необходимое количество уксусной кислоты, чтобы снизить pH до нужного значения. После этого центрифугированием удаляют обломки разрушенных клеток.
Бактерии
Бактериальные клетки можно разрушить ультразвуком, с помощью шаровой мельницы или пресса Френча, хотя не все эти способы удобны для приготовления больших объемов экстракта. В случае небольших объемов клетки можно растирать с окисью алюминия. Грамположительные бактерии обычно чувствительны к лизоциму. Для высвобождения компонентов ци-
46
Глава 2
топлазмы бывает достаточно 15-минутного перемешивания суспензии клеток в буфере, содержащем 0,2 мг/мл лизоцима яичного белка, при 37°С. Обработка полученного экстракта дезоксирибонуклеазой I (ilO мкг/мл) улучшает его качество, так как при этом вязкость жидкости уменьшается.
Грамотрицательные бактерии, если их предварительно не обрабатывать, менее чувствительны к лизоциму. Недавно описан способ комбинированной обработки клеток неионным детергентом, осмотическим шоком и лизоцимом [14]. Модификацию этого метод?' используют при экстракции грамотрйцательных микроорганизмов Zymomonas mobilis и Photobacterium phos-phoreum. При этом достигается исчерпывающая экстракция ферментов, хотя полного диспергирования клеточной стенки не происходит.
