Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
42
Глава 2
Эти методы служат для разрушения клеток и выделения ферментов в раствор. Если фермент локализован в органеллах, метод может быть использован только при условии, что орга-неллы также разрушаются. С другой стороны, может понадобиться предварительное выделение самих органелл, что позволит избавиться от загрязнения цитоплазматическими ферментами перед экстракцией фермента из органелл. Для этого требуется менее сильное воздействие. Предварительное растворение поверхностных коллагеновых и целлюлозных структур препаратами гидролитических ферментов позволяет в дальнейшем разрушать клетки более мягкими способами, сохраняя целостность органелл. Примером подобной методики служит получение препаратов митохондрий из таких тканей, как скелетная или сердечная мышцы, под действием протеолитических ферментов [6]. Однако эта методика применима только для получения препаратов в небольших масштабах и больше подходит для метаболических исследований органелл, чем для очистки ферментов. Выход очищенных органелл может быть очень низким, поэтому во многих случаях лучше сначала разрушить всю ткань, а затем уже приступить к выделению нужного фермента из сложной смеси белков в экстракте. Таким образом, ферменты митохондрий и хлоропластов часто получают из тканевого гомогената, а не из выделенных органелл.
Наконец, фермент может быть нерастворим в буфере, используемом для экстракции. В этом случае необходим специальный подход, который кратко рассматривается в разд. 2.4.
После разрушения клеток и осаждения нерастворимого материала центрифугированием получают «экстракт». Смесь до центрифугирования обычно называют гомогенатом. После центрифугирования в жидкой фазе должна находиться по возможности большая часть фермента, присутствовавшего в исходном материале. Часть жидкости удерживается осадком, и общие потери будут пропорциональны отношению объема осадка к объему жидкой фазы. При получении экстракта потери за счет удерживания жидкости осадком не должны составлять более 20%, если только сырье не очень легко доступно, и высокая концентрация фермента при малом объеме экстракта не является более важным условием, чем полное выделение фермента из гомогената. Если объем жидкости, удерживаемой осадком, составляет половину объема осадка, то отсюда можно подсчитать, что для выделения 80% фермента необходимо, чтобы объем надосадочной жидкости в два раза превышал объем осадка. Большинство животных тканей содержит значительное количество нерастворимого клеточного материала, который связывает много воды. При работе с ними объем осадка получается практически равным исходному объему ткани (в некоторой
Приготовление экстракта
43
мере это зависит от условий центрифугирования). Таким образом, когда получают гомогенат, скажем, из печени, необходимо добавить по крайней мере два объема подходящего экстрагирующего буфера. Чем больше буфера будет добавлено, тем большая часть растворимой фракции экстрагируется, но экстракт будет более разбавленным; его большой объем может создать трудности в дальнейшей работе. Для приготовления гомогенатов из печени, сердца и скелетных мышц обычно добавляют 2,5 объема экстрагирующего буфера.
Растительные ткани значительно отличаются от животных. Как указывалось в предыдущем разделе, внутриклеточное содержимое составляет лишь малую часть объема растительной ткани. Наличие больших вакуолей (рассматриваемых здесь как внеклеточные образования) и межклетников служит причиной высвобождения большого количества жидкости при разрушении ткани. В этом случае практически не требуется добавления экстрагирующей жидкости. Объем осадка после центрифугирования может составлять только 20—40% объема исходной растительной ткани. Тем не менее использование дополнительного экстрагирующего раствора может быть очень важно для контролирования нежелательных процессов, происходящих во время гомогенизации. Такими процессами могут быть подкисление среды или окисление нестойких соединений. Особую проблему представляют растения, содержащие фенольные соединения, которые окисляются в основном под действием эндогенных фено-локсидаз с образованием темных пигментов. Эти пигменты ковалентно соединяются с белками и инактивируют многие ферменты. Пригодны два способа решения этой проблемы. Во-первых, добавление какого-либо тиолового соединения, например p-меркаптоэтанола, сводящего до минимума действие фенол-оксидаз. Во-вторых, часто оказывается полезным добавление порошкообразного поливинилпирролидона, адсорбирующего фенольные соединения.
По объему осадка, получаемому после центрифугирования, микроорганизмы больше похожи на животные ткани. Дрожжи и сходные с ними грибы с толстой клеточной стенкой дают осадок, объем которого практически равен исходному объему клеточного материала. То же самое характерно и для бактерий. Если в процессе экстракции действуют значительные силы сдвига, в раствор может перейти большое количество материала клеточной стенки. Это создает новые проблемы, которые будут обсуждаться далее (разд. 2.3).
Обломки клеток легко отцентрифугировать. Это особенно относится к крупным обломкам животных и растительных тканей. Однако после центрифугирования, например, при 10 ОООg в течение 15 мин в суспензии остаются внутриклеточные части-
