Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Разделение белков путем осаждения
6!
мент стабилен при используемом значении pH. Стабильность белка повышается, а растворимость его снижается при низкой температуре. Однако, если pH устанавливают при 0°С, не надо забывать, что рН-метр необходимо откалибровать при той же температуре, используя для этого охлажденный стандартный буфер (разд. 6.1).
Подводя итог всему сказанному выше, следует отметить, что область «всаливания» может быть использована в процессе очистки двумя способами. Во-первых, агрегация может происходить при разведении и диализе, и, если нужный фермент присутствует в агрегате, очистка будет эффективной. Во-вторых, можно применять изоэлектрическое осаждение, используя изменение растворимости в зависимости от pH при постоянной ионной силе. В любой из этих двух ситуаций степень достигнутой очистки обычно оказывается минимальной, если нужный фермент остается в растворе, так как при этом в осадок выпадает чаще всего лишь относительно незначительная часть всего белка. В этом случае достигается только осветление экстракта (разд. 2.3).
3.3. ВЫСАЛИВАНИЕ ПРИ ВЫСОКОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ СОЛИ
Общие аспекты растворимости белков при высокой концентрации соли
В этом разделе описан один из наиболее широко применяемых способов очистки ферментов — высаливание белков при высокой концентрации солей. Этот способ отличается по своему результату от «всаливания», описанного в разд. 3.2. Хотя белки типа глобулинов (т. е. белки, растворимость которых низка при низкой ионной силе вблизи их изоэлектрической точки) обычно характеризуются также относительно низкой растворимостью и при высокой концентрации соли, из этого правила есть много исключений. Так, сывороточные у"гл°булины, типичные белки, нерастворимые при низкой солевой концентрации, осаждаются сульфатом аммония (при относительно низкой его концентрации— около 1,5 М). С другой стороны, некоторые другие сывороточные глобулины (а и р) обладают более высокой растворимостью в сульфате аммония и осаждаются им при концентрации около 2,5—3,0 М. Процесс высаливания в основном зависит от гидрофобности белка, тогда как «всаливание» в большей степени определяется распределением зарядов на поверхности белковой глобулы и полярными взаимодействиями ее с растворителем.
В растворе типичная белковая молекула имеет гидрофобные участки (боковые цепи Phe, Туг, Trp, Leu, lie, Met и Val)..
62
Г лава 3
Рис. 3.5. Упорядоченное расположение молекул воды вокруг гидрофобных остатков на поверхности белка.
Их соприкосновение с водным растворителем приводит к упорядочению структуры воды, которая как бы «замораживается» вокруг боковых цепей аминокислотных остатков (рис. 3.5) [25]. Такое упорядочение структуры термодинамически неустойчиво, так как в подобной системе происходит значительное снижение энтропии по сравнению с системой негидратирован-ный белок — свободные молекулы воды.
Если процесс растворения сухого белка в воде представить в виде
где яНгО — молекулы воды, упорядоченно расположенные вокруг гидрофобных остатков (мы исключаем из рассмотрения молекулы воды, свя-занные с белком водородными и другими полярными связями)» тогда AS0 будет большой отрицательной величиной, что определяется степенью упорядочения молекул. Поскольку процесс растворения идет спонтанно» значение A G0, очевидно, будет отрицательным. Следовательно, ДЯ° также отрицательная величина (\H°=AG0+T&S°)t Рассмотрим две близко расположенные молекулы белка, которые взаимодействуют своими гидрофобными остатками, освобождая при этом воду:
Ясно, что в этом случае AS0 будет большой и притом положительной величиной. Можно ожидать, что изменение энтальпии данного процесса будет обратным по сравнению с ее изменением для процесса, описанного уравнением (3.1), т. е. будет положительным. Значит, величина AG0 мала, а ее знак будет зависеть от относительных значений АН° и AS0. При низкой концентрации соли ДС° для типичного водорастворимого белка положительна. Так как белок растворим, заметной агрегации (уравнение 3.2) происходить не будет. Однако, если молекулы воды, освободившиеся в описанном процессе (3.2), захватываются какими-либо другими молекулами, взаимодействие белковых молекул может привести к агрегации белка. Ионы солей подвергаются гидратации, и поэтому при
Р + пН20------Р*лН20,
(3.1)
Р• пН20 + Р'• тН20 -> Р—Р' + (л+т)Н20.
(3.2)
Разделение белков путем осаждения
63.
добавлении значительного количества соли происходит связывание воды:
АВ + (пг + п2) Н20 --->• Л+'Л^О + В"*л2Н20. (3.3)
(соль)
Агрегация, описанная уравнением (3.2), наблюдается во всех случаях, когда белок освобождается от достаточного количества воды. Следует отметить, что ДЯ° этой реакции положительна. В результате, согласно уравнению Аррениуса, агрегация, обусловленная гидрофобными взаимодействиями, усиливается с увеличением температуры. Это известная особенность гидрофобных взаимодействий. Осаждение белков при добавлении солей в большинстве случаев характеризуется положительным значением АН0, так как при данной концентрации соли повышение температуры вызывает образование большего количества осадка.
