Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Иногда лучше замораживать экстракт, так как его состав можно менять в целях достижения оптимальных условий хранения. После получения экстракта к нему можно добавить ингибиторы протеолитических ферментов (разд. 6.2) и довести его pH подходящим буфером до значения, при котором ферменты
Приготовление экстракта
39
стабильны. Кроме того, экстракт можно получить из большого количества материала, так что образцы, взятые впоследствии из морозильника, будут различаться лишь временем хранения. Различия в их свойствах в этом случае не будут обусловлены биологическими различиями замороженного материала.
Следует помнить, что очень важна скорость оттаивания: чем она выше, тем лучше (при условии, что не происходит местного перегрева). Лучше всего погружать контейнер в теплую воду (40—50 °С) и почаще его встряхивать. По всей вероятности, в этих условиях температура оттаявшего раствора не будет подниматься выше 10 °С до тех пор, пока не растает весь лед.
Теперь, когда мы располагаем свежим или оттаявшим материалом, можно приступить к гомогенизации и приготовлению экстракта, содержащего фермент в растворе. В большинстве случаев это первый этап очистки ферментов. Выделение субклеточных частиц или другого нерастворимого материала, которое проводят перед тем, как перевести фермент в раствор, кратко описано ниже (разд. 2.4).
2.2. РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОК И ЭКСТРАКЦИЯ
Большая часть белков и ферментов, изученных в ранний период истории белковой химии, была выделена из внеклеточных жидкостей. Причина этого заключается не только в легкости получения материала, но и в том, что внеклеточные белки в основном более стабильны часто благодаря наличию в них дисульфидных мостиков, а также небольшим размерам молекул. Первоначально исследования структуры белков, естественно, сосредоточивались на этих небольших белках. Так, лизоцим, рибонуклеаза и химотрипсин были самыми первыми детально изученными белками, и все они получены из внеклеточных источников. Однако большинство ферментов локализовано внутри клеток. Часто такие белки менее стабильны — у них обычно отсутствуют дисульфидные связи вследствие того, что внутриклеточная среда обладает восстанавливающими свойствами. Цель данного раздела — дать описание методов разрушения клеток и выделения ферментов в водный «экстракт», что является первым этапом очистки ферментов.
Существует множество методов разрушения клеток, что обусловлено разнообразием типов клеток. Большинство клеток имеют присущие только им особенности, которые следует учитывать при их разрушении. Животные ткани широко варьируют по своей прочности: наряду с легко разрушаемыми эритроцитами используется и жесткий коллагенсодержащий материал, встречающийся в кровеносных сосудах и других тканях, содер-
Таблица 2,1. Способы разрушения клеток
Способ
Пример
Принцип
Мягкое воздействие
Лизис клеток
Эритроциты
Разрушение под Обработка бакте-действием фер- рий лизоцимом ментов
Химическая солю- Экстракция дрож-билизация и- ав- жей толуолом
Гомогенизация
вручную
Размельчение
(растирание)
Воздействие средней силы
Лопастной гомогенизатор (ти(па Уоринга)
Растирание с абразивом (например, с песком или окисью алюминия)
Сильное воздействие
Пресс Френча
Ткань печени
Мышечная ткань И др.
Мышечная ткань, большинство животных тканей, растительные ткани Растительные ткани, бактерии
Ультразвук
Бактерии, растительные клетки
Суспензии клеток
Шаровая мельни- Суспензии клеток да
Гомогенизатор Суспензии клеток Мзнтона — Гау-лина
Осмотическое разрушение клеточной мембраны Разрушение клеточной стенки приводит к осмотическому разрыву клеточной мембраны Клеточная стенка (мембрана) частично растворяется под действием химических веществ, освободившиеся при этом литические ферменты завершают процесс Клетки продавливают через узкий зазор, что приводит к разрушению клеточной мембраны Клетки разрушаются >в процессе размельчения ткани под действием силы сдвига
Происходит механическое разрушение крупных клеток и отделение друг от друга мелких
Разрушение клеточных стенок происходит благодаря наличию на частицах абразива микрошероховатостей
Клетки продавливают через маленькое отверстие под очень большим давлением; они разрушаются под действием силы сдвига Ультразвуковые волны создают высокий локальный градиент давления; в результате клетки разрушаются под действием напряжения сдвига и кавитации Разрушение клеточной стенки происходит под действием быстрой вибрации стеклянных шариков Действует так же, как и пресс Френча, но позволяет обрабатывать большие количества материала
Приготовление экстракта
41
Рис. 2.2. Оборудование, используемое для разрушения клеток при получении экстракта. Л. Ручной или механический стеклянный гомогенизатор. Б. Лопастной смеситель (бытовой миксер). В. Ультразвуковой гомогенизатор. Г. Вибрационная шаровая мельница. Д. Клеточный дезинтегратор Мэитона — Гаулина.
жащих гладкие мышцы. Растительные клетки обычно труднее разрушаются, чем животные, из-за наличия у них целлюлоз-ной оболочки. Среди бактерий есть и довольно хрупкие организмы, которые могут быть разрушены пищеварительными ферментами или просто под действием осмотического шока, и более устойчивые, с толстой клеточной стенкой; для разрушения последних необходимо сильное механическое воздействие, которое, однако, не должно быть чрезмерным, так как при этом могут инактивироваться лабильные ферменты. В табл. 2.1 приводится перечень используемых методик, иллюстрации к которым даны на рис. 2.2.
