Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
зацией праймеров. Действительно, поскольку популяция праймеров включает все возможные последовательности, в ней находятся пары праймеров, комплементарные друг другу, что является предпосылкой для образования димеров, т.е. происходит независимая от матрицы неспецифическая амплификация последовательностей.
Проблему образования димеров в РЕР-ПЦР пытаются решать с помощью варианта метода, получившего название ПЦР со случайными мечеными праймерами (tagged random primer PCR - T-PCR) [319]. В этом случае при амплификации использовали смесь всевозможных 9-звенных олигонуклеотидных праймеров, каждый из которых содержал 5'-концевую метку в виде постоянной 17-нуклеотидной последовательности:
GTTTTCCCAGTCACGACN9,
где N - один из четырех возможных нуклеотидов. После проведения нескольких раундов ПЦР праймеры и их димеры отделяли от продуктов реакции с помощью гель-фильтрации, а сами продукты использовали в качестве матрицы в ПЦР с 17-звенным праймером, соответствующим 5'-концевым последовательностям матричных продуктов реакции. В итоговой смеси продуктов ПЦР последовательности нуклеотидов исследуемой хромосомы I дрожжей S. pombe были равномерно и специфически представлены. Дальнейшее усовершенствование этого подхода привело к созданию праймеров следующей похожей структуры:
AAGTCGCGGCCGCN6ATG,
в которых случайная 6-звенная последовательность была фланкирована постоянными последовательностями 13-нуклеотидной 5'-концевой маркерной и З'-концевым тринуклеотидом. Последний тринуклеотид позволял праймерам инициировать синтез ДНК со специфических фиксированных точек анализируемых последовательностей хромосом, случайная 6-нуклеотидная последовательность служила для стабилизации праймеров в гибридах, поскольку в сложной смеси исходных праймеров всегда находился один, З'-концевая 9-звенная последовательность нуклеотидов которого была полностью комплементарна соответствующей последовательности ампликона. Длину постоянной З'-конце-вой последовательности праймеров в этих исследованиях изменяли в пределах трех-шести нуклеотидов.
Разработка систем амплификации целых геномов особенно актуальна для проведения молекулярно-генетических исследо-
ваний на уровне отдельных клеток, в том числе для осуществления пренатальной диагностики на стадии предимплантации зародыша [320]. Информацию о других применениях ПЦР с использованием нуклеиновых кислот индивидуальных клеток в качестве матриц (single-cell PCR) можно найти в недавнем обзоре [321].
6.6. Альтернативные способы амплификации нуклеиновых кислот in vitro
Рассмотренные выше многочисленные приложения ПЦР к генетическим и молекулярно-биологическим исследованиям наглядно иллюстрируют неисчерпаемые возможности этой группы методов, которые во многих случаях способны заменить клонирование ДНК классическими генно-инженерными способами. В настоящее время трудно представить себе, что в ближайшем будущем ПЦР может быть вытеснен каким-либо альтернативным методом исследования нуклеиновых кислот. Тем не менее, поиск новых методов амплификации нуклеотидных последовательностей, менее требовательных к строгому контролю за температурными режимами проведения реакции, продолжается и по сей день. Работы в этом направлении стимулируются еще и тем, что исследователей не оставляет надежда преодоления патентных ограничений, связанных с методами, в основе которых лежит ПЦР. На этом фронте молекулярно-генетических исследований уже имеются несомненные достижения.
6.6.1. Лигазная цепная реакция
Способность ДНК-лигаз восстанавливать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах двухцепочечных молекул ДНК используется при проведении лигазной цепной реакции - ЛЦР (ligase chain reaction - LCR) [85, 322, 323]. Для этого синтезируют два олигонуклеотида, комплементарные непрерывной последовательности нуклеотидов ДНК, которые после гибридизации с такой последовательностью примыкают друг к другу и разделены лишь одноцепочечным разрывом. При этом З'-конец предшествующего нуклеотида должен содержать свободную З'-ОН-группу, а в 5'-положении 5'-конца олигонуклеотида, следующего за ним, должна находиться фосфатная группа.
В первом цикле ЛЦР два синтезированных олигонуклеотида отжигаются с исследуемой денатурированной ДНК (как и при
ПЦР) в присутствии термостабильной ДНК-лигазы, а также всех остальных необходимых кофакторов и ионов. Реакционную смесь прогревают до температуры, оптимальной для лигирования, после чего между отожженными олигонуклеотидами образуется фосфодиэфирная связь, соединяющая оба олигонуклеотида друг с другом. Затем температуру реакционной смеси повышают до температуры плавления гибрида, образованного анализируемой ДНК и лигированными олигонуклеотидами, которые освобождаются в реакционную смесь в составе единого фрагмента. Во время второго цикла температуру реакционной смеси вновь понижают до температуры отжига олигонуклеотидов, которые, находясь в молярном избытке по отношению к освободившимся продуктам реакции, преимущественно гибри-дизуются с ДНК. Далее, связавшиеся олигонуклеотиды снова лигируют, и образовавшийся продукт реакции освобождают из гибрида повышением температуры. При этом содержание продукта в реакционной смеси удваивается. После проведения п циклов ЛЦР в реакционной смеси теоретически может оказаться пх молекул продукта реакции, где х - число пар олигонуклеотидов, вступающих в реакцию в каждом цикле, теоретически равное числу копий анализируемой последовательности нуклеотидов в реакционной смеси.
