Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
6.4.2. Понижение сложности амплифицируемой ДНК
с помощью ПЦР (метод RAPD)
Термин “сложность генома” используют для описания всевозможных присутствующих в нем последовательностей ДНК. Для генома, состоящего из повторяющихся и уникальных последовательностей, сложность генома определяется в виде нормированной суммы всех последовательностей по следующей формуле:
Ety/m,.,
где т,- обозначает число повторов в геноме /-той последовательности, состоящей из N( п.о. [314]. Сложность генома определяет скорость гибридизации уникальных последовательностей с препаратами ДНК. В этой связи специфическое селективное понижение сложности препарата ДНК могло бы ускорить и облегчить проведение его анализа с помощью гибридизации. Решение этой проблемы затрудняется тем, что исследователь редко располагает достаточным количеством информации о последовательностях ДНК анализируемого генома с неизвестной первичной структурой для осуществления выбора его представительной части с целью дальнейшего использования при амплификации с помощью ПЦР.
Несмотря на нетривиальный характер задачи, в настоящее время имеется методический подход, позволяющий с помощью ПЦР понижать сложность образца ДНК без каких-либо предварительных знаний о его первичной структуре. Метод получил название случайной амплификации полиморфных последовательностей ДНК (random amplified polymorphic DNA-RAPD). Метод основан на использовании в ПЦР коротких праймеров со случайной последовательностью нуклеотидов. При этом в конкретной ПЦР чаще всего используется только один праймер. В этом случае продукт ПЦР будет образовываться, если инвертированные повторяющиеся последовательности, которые содержат в себе сайт посадки такого праймера, будут располагаться в анализируемом геноме достаточно близко друг от друга, на расстоянии, допускающем эффективное прохождение ПЦР. Приняв такое расстояние равным 2 т.п.о., и исходя из статистических расчетов вероятности встречаемости в геноме размером 3 х 109 п.о. двух одинаковых случайных последовательностей конкретной длины, можно теоретически определить число соответствующих ампликонов в таком геноме. Результаты таких расчетов представлены в табл. 9.
Из результатов, представленных в таблице, становится ясным, что, используя простейший прием включения в реакционную смесь одного короткого праймера со случайной последовательностью, можно с помощью ПЦР амплифицировать конкретную (хотя заранее не определенную) часть генома с неизвестной первичной структурой. При этом сложность образующихся продуктов ПЦР можно контролировать с помощью длины олигонуклеотида, используемого в качестве праймера. Этот метод успешно используется для поиска информативных полиморфных маркеров, пригодных для физического картирования геномов животных и растений, а также идентификации организмов путем получения фингерпринтов их ДНК [315, 316].
Расчетный результат ПЦР-амплификации методом RAPD с помощью одного нуклеотида указанной длины [314]
Длина олигонуклеотида- Число ампликонов Суммарная длина амплифици-
праймера (нт) рованной ДНК (п.о.)
8 1500 1,5 X 106
9 100 1,0 X 105
10 6 6,0 X 103
Примечание. Суммарная длина амплифицируемого генома принимается равной
3 X 10 п.о.
6.5. Одновременная амплификация последовательностей целого генома
Одним из ограничений проведения генетических исследований in vitro является малая доступность биологического материала. В частности, клетки дифференцированных тканей часто невозможно культивировать без утраты ими своего исходного фенотипа. Многие типы клеток, например сперматозоиды, вообще невозможно культивировать. Хотя с помощью известных праймеров можно амплифицировать отдельные участки генома, после проведения ПЦР остальной неамплифи-цированный генетический материал оказывается потерянным. В этой связи предпринимаются попытки разработки методов амплификации значительной части генетического материала на первом этапе его изучения с целью резервирования для дальнейшей работы.
Метод преамплификации с удлинением праймеров (primer extension preamplification - PEP) позволяет частично решать вышеупомянутую проблему [317,318]. При реализации этого подхода в ПЦР используют смесь вырожденных коротких (часто 15-нуклеотидных) праймеров, которые представлены всевозможными (415) последовательностями. Хотя концентрация каждого отдельного праймера в такой смеси мала, ее оказывается достаточно для амплификации с некоторой эффективностью каждого соответствующего сегмента анализируемой ДНК с образованием ~30 копий продуктов ПЦР после проведения 50 циклов. Ампли-фицированные участки могут представлять до 80% последовательностей всего генома. Практическая реализация обсуждаемого подхода сопровождается артефактами, связанными с димери-
