Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Праймер S1 и зонд гибридизуются с последовательностью, расположенной непосредственно перед делецией, и эта мутация не оказывает влияния на их взаимодействие с матричной ДНК. Место посадки праймера S2 удаляется делецией, и в этом случае соответствующий ПЦР-продукт не образуется в присутствии праймеров S1 и S2 в реакционной смеси, хотя реакция на мутантной матрице пройдет в присутствии праймеров S1 и S3, которые, в свою очередь, не функционируют на ДНК без делеции из-за слишком большого расстояния между этими праймерами. Таким образом, образование продукта ПЦР как в присутствии праймеров SI + S2, так и S1 + S3 в реакционной смеси свидетельствует о наличии гетерозиготной делеции SEA в ДНК, как это представлено на рис. 24, б. Хотя теоретически эффективность образования продуктов ПЦР в присутствии обеих пар праймеров при наличии гетерозиготной делеции SEA должна быть идентичной, выявляемые с помощью ПЦР в реальном времени различия могут быть связаны с длинами ампликонов, поскольку все остальные условия проведения ПЦР в этих опытах были одними и теми же. С помощью серийных разведений образцов ДНК определили чувствительность системы ПЦР в реальном времени, которая в обсуждаемом примере позволяла обнаруживать 0,28 нг (~20 копий) ДНК в пробе (рис. 24, в).
Прогресс количественной ПЦР в формате TaqMan во многом обязан разработке зондов, которые позволяют эффективно обнаруживать 5'—>3'-экзонуклеазную активность термостабильных ДНК-полимераз в реальном времени. В качестве флуорофора часто используют 6-карбоксифлуоресцеин (FAM), а тушителя флуоресценции - 6-карбокситетраметилродамин (TAMRA) [303]. В качестве тушителя флуоресценции часто применяют Dabcyl (4-(4'-dimethylaminophenylazo)benzoic acid). В паре с ним TAMRA уже выступает в роли флуорофора. Оптимальная длина ампликона для ПЦР в реальном времени, как правило, меньше 100 п.о. (60-80 п.о.). ПЦР-продукты, полученные с использованием ампликонов такой длины, более эффективно денатурируют, а время
фазы элонгации может быть сокращено до 10-15 сек, что заметно ускоряет весь процесс амплификации.
Система FRET. Оценку скорости образования продуктов ПЦР в реальном времени осуществляют и с использованием других физических принципов. В частности, функционирование зондов второго типа основано на резонансном переносе энергии флуоресценции (fluorescent resonance energy transfer - FRET) [304]. В этом случае два олигонуклеотида, специфичные в отношении продукта ПЦР, тандемно гибридизуют с продуктом в каждой фазе отжига праймеров. Выше расположенный зонд содержит на своем З'-конце возбуждающий краситель (в частности, FITC), а следующий за ним олигонуклеотид мечен по 5'-концу красите-лем-репортером (например, RED640). Таким образом, в этой системе два вышеупомянутых красителя оказываются пространственно сближенными друг с другом после гибридизации с продуктом ПЦР. После этого возбуждение FITC сопровождается переносом электронов на акцепторную молекулу RED640, которая испускает кванты света определенной энергии в более длинноволновой части спектра. Интенсивность флуоресценции четко коррелирует с количеством связавшихся зондов, а, следовательно, и с количеством образовавшегося продукта ПЦР.
“Молекулярные маяки”. Третий тип зондов, используемых для обнаружения специфических продуктов ПЦР в реальном времени, получил название “молекулярных маяков” (molecular beacons) [305, 306] (рис. 23, б). Такие олигонуклеотиды обладают тремя характерными чертами. К 5'- и З'-концам “молекулярного маяка” присоединены, соответственно тушитель флуоресценции и флуорохром. Последовательности, непосредственно примыкающие к этим красителям, самокомплементарны, поэтому в реакционной смеси такие зонды приобретают структуру типа “стебель-петля”, в которой тушитель и флуорохром пространственно сближены, и флуоресценция флуорохрома-репортера подавлена. В качестве тушителей флуоресценции в этих системах часто используют нефлуоресцирующие хромофоры, которые, получив энергию от флуорофора, рассеивают ее в виде тепла. Область петли зонда содержит последовательность, комплементарную анализируемому продукту ПЦР. При температурах более низких, чем температура отжига зонда на продукт ПЦР, структура стебля сохраняется и “молекулярный маяк” находится в выключенном состоянии. После образования гибрида между зондом и продуктом ПЦР или Денатурации зонда тушитель и флуорохром пространственно разделяются, флуорохром начинает флуоресцировать, то есть “маяк” зажигается и начинает функционировать. Возбуждение элек-
тронов красителей осуществляют аргоновым лазером, а с помощью оптико-волоконного кабеля испускаемый свет выводится в прибор с зарядовой связью, данные от которого обсчитываются компьютером с помощью специальных алгоритмов.
Системы ПЦР в реальном времени, основанные на “молекулярных маяках”, обладают гораздо большей специфичностью, чем система TaqMan, и позволяют обнаруживать одиночные замены нуклеотидов в ДНК. Кроме того, в отличие от последней системы, они пригодны для количественной оценки содержания продукта ПЦР в реакционной смеси по завершении реакции с помощью флуориметра. “Молекулярные маяки” могут быть использованы и для обнаружения продуктов реакции в системах изотермической амплификации, которые будут подробнее рассмотрены ниже [307].
