Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
г 3'
5'
11Ш111ШП1МГ1Ш111П
тттггтттттттттттттттттг
тп
J'..............11111М1ПМЧИИИ.....mill.... у
Отжиг праймера и "молекулярного маяка"
I
5' 11111111и1111ччги11111п11п11ппн11111тппттптттгпт
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
3'
5'
3'
5' 5'-
3'-
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
^ Полимеризация 5 шп^пт^шшштспгсшштттшшгг
3'-
Рис. 23. Обнаружение продуктов ПЦР в реальном времени с использованием зондов TaqMan (а) и “молекулярных маяков” (б) [279]
флуоресценции. Зонд отжигается в каждом цикле ПЦР с центральным участком ампликона между двумя амплифицирующими его праймерами. Для того, чтобы сам зонд не использовался в качестве праймера, его 3-концевую гидроксильную группу блокируют ортофосфатом. Элонгацию праймеров проводят при той Же температуре, что и температура отжига праймеров и зонда. Во время ПЦР на стадии элонгации праймера Taq-полимераза, Достигнув 5'-конца зонда, начинает вытеснять его из дуплекса, а
8. Патрушев Л.И. Т. 1
225
затем отщепляет 5'-концевой нуклеотид зонда, меченный флуо-рофором, в точке раздвоения цепей ДНК и зонда [299]. Поскольку экзонуклеазная активность Taq-полимеразы специфична в отношении двухцепочечных ДНК [300], зонд, находящийся в реакционной смеси в свободном состоянии, остается интактным. По мере углубления ПЦР интенсивность флуоресценции реакционной смеси увеличивается, и это возрастание происходит ступенчато по завершению стадии элонгации праймера в каждом цикле ПЦР. Свободный зонд, находясь в растворе в контакте с тушителем флуоресценции, создает небольшой базальный уровень флуоресценции, который преодолевается по мере накопления свободного флуорофора в реакционной смеси. С этого момента, определяемого числом прошедших циклов ПЦР, которое называют порогом числа циклов (Ct - threshold cycle), появляется возможность наблюдать в реальном времени за кинетикой накопления флуорофора в реакционной смеси. Значение Ct обратно пропорционально количеству амплифицируемой матрицы в пробе. Чем выше концентрация амплифицируемой последовательности в реакционной смеси, тем меньшее количество циклов требуется для того, чтобы интенсивность флуоресценции освободившегося флуорофора в пробе превысила базальный уровень.
Физическое разделение флуоресцентных красителей - репортера и тушителя флуоресценции - в процессе гидролитического разрушения зонда снимает подавление флуоресценции в анализируемой части спектра. Максимальный сигнал флуоресценции получают в том случае, если в зонде оба красителя максимально удалены друг от друга, т.е. находятся на 5'- и 3'-концах олигонуклеотида. Это вызвано, по-видимому, более эффективным расщеплением зонда ДНК-полимеразой [301]. Поскольку ДНК-полимераза может гидролизовать зонд лишь в составе гибрида с ДНК-матрицей, температура стадии элонгации праймера не должна превышать температуру плавления (Тм) гибрида. Большинство используемых зондов обладают Тм ~70°С, поэтому на практике при проведении ПЦР в реальном времени в системе TaqMan стадии отжига зонда и праймеров, а также элонгации объединяют и проводят при 60-62°С. Это приводит к тому, что ДНК-полимераза функционирует в субоптимальных условиях и делает всю систему TaqMan менее эффективной и гибкой по сравнению с системами ПЦР в реальном времени, основанными на других принципах (см. ниже).
На рис. 24 представлены результаты использования ПЦР в реальном времени в формате TaqMan для обнаружения гетерозиготной делеции, приводящей к развитию а-талассемии у челове-
Сг
J'HYR
-w—
q>Ci ф«2 Ф0С1 а2 щ
0,
5'HVR
—W-
б
Зонд TaqMan
SI S2
S3
Делеция ‘ SEA
1
2
у = 30,54 - 2,87х Коэффициент корреляции = -0,9965
ДНК (нг)
Рис. 24. Обнаружение делеции SEA в гетерозиготном состоянии у пациентов с а-талассемией с помощью ПЦР в реальном времени в формате TaqMan [302]
а - схема расположения кластера а-глобиновых генов человека и делеции SEA; HVR - гипервариабельный участок, S1-S3 - праймеры, использованные в ПЦР, стрелка указывает на флуоресцентно меченный зонд;
б - кинетика накопления свободного флуорофора при анализе ДНК пациента, содержащего гетерозиготную делецию SEA; ПЦР проводили в разных пробирках: 1 - с праймерами S1 и S2; 2 - с праймерами S1 и S3; 3 - базовая линия, полученная с помощью контрольного образца, в котором отсутствует матрица;
в - определение чувствительности метода с праймерами S1 и S2, Ct - порог числа циклов
ка [302]. а-Талассемия представляет собой генетическое заболевание, сопровождающееся резким снижением или полным прекращением биосинтеза а-глобина. В Юго-Восточной Азии 60-90% потерь плода, вызванных водянкой, связано с гомозиготной делецией SEA длиной ~20,5 т.п.о., которая удаляет оба а-гло-биновых гена, локализованных на хромосоме 16, но оставляет интактным ген эмбрионального ^-глобина (рис. 24, а). В этой связи определение носительства делеции среди населения Юго-Восточной Азии является весьма актуальным.
