Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 25. Праймеры типа “Скорпион”, используемые для обнаружения продуктов ПЦР в реальном времени [279]
Олигонуклеотиды этого типа объединяют в одной (а) или двух (б) молекулах специфический праймер для ПЦР, расположенный в их 3'-концевой части, флуорофор на 5'-конце, тушитель флуоресценции, находящийся вне праймера ближе к его 5'-концу, и ингибитор (блокатор) синтеза ДНК, препятствующий использованию 5'-концевой части олигонуклеотида во время ПЦР в качестве матрицы. Кроме того, центральная часть олигонуклеотида комплементарна 5'-концевому участку амплифицируемого продукта ПЦР, что удерживает флуорофор вдали от тушителя флуоресценции после образования петли ДНК в фазе отжига праймеров
отжига праймеров и их удлинения последовательность петли “Скорпиона” внутримолекулярно гибридизуется с продуктом ПЦР, что приводит к разделению флуорофора и тушителя и сопровождается появлением сигнала флуоресценции. Последовательность ампликона, с которой гибридизуется петля, обычно начинается через три нуклеотида от З'-конца праймера “Скорпион”. В этих условиях внутримолекулярная гибридизация становится кинетически более предпочтительной, поскольку она не зависит от вероятности встречи зонда, который присутствует в реакционной смеси в низкой концентрации, с другим продуктом ПЦР. Это позволяет проводить ПЦР в условиях более коротких
циклов, а возникающий при этом сигнал обладает значительно большей интенсивностью, чем сигналы, генерируемые зондами TaqMan и “молекулярными маяками” [310].
При использовании стандартных праймеров “Скорпион” имеет место некоторое тушение флуоресценции даже после их гибридизации с ампликоном, из-за пространственной близости флу-орофора и тушителя флуоресценции. Дальнейшее усиление интенсивности сигнала в этой системе достигается путем отделения флуорофора и тушителя друг от друга, которые связывают с отдельными олигонуклеотидами, комплементарными друг другу (рис. 25, б).
6.4. Амплификация последовательностей с неизвестной первичной структурой
Для амплификации последовательностей с использованием обычной ПЦР необходимо знание первичной структуры обеих последовательностей, фланкирующих анализируемый ампликон, что является существенным ограничением использования метода в анализе последовательностей неизвестной структуры. В исследовательской работе часто встречаются ситуации, когда известна последовательность, расположенная с одной стороны ампликона, а другую требуется определить, то есть совершить переход от известной последовательности генома к соседней неизвестной. Для решения этой задачи создано несколько методов, объединенных под общим названием односторонней ПЦР (single-sided PCR).
6.4.1. Использование ПЦР для продвижения вдоль ДНК от участка с известной первичной структурой в сторону неизвестной последовательности
Теоретически наиболее просто проблема амплификации неизвестной последовательности решается в том случае, если она входит в состав рестрикционного фрагмента ДНК, длина которого допускает его использование для ПЦР, и к ней прилегает последовательность с известной первичной структурой (изображена пунктирной линией на рис. 26, а) [311]. К обоим концам фрагмента по открытым сайтам рестрикции с липкими концами присоединяют олигонуклеотидные адаптеры, иногда называемые шплинтами (splints), что позволяет в дальнейшем использовать последовательности адаптеров в качестве мест посадки праймеров при ПЦР. В удачно складывающихся обстоятельствах при использовании двух праймеров, комплементарных известному уча-
Лигирование
адаптеров
Добавление
праймеров
б
5' ОН-
3' он-
ОН Р-----------
ОН ------------Р
Лигирование
1
Ъ-сш-
1
| Денатурация
| ДНК-полимераза I
ПЦР
“W
h-i—I-----¦¦ I Лигирование
I Очистка со Г Денатурация
I стрептавидином | Отжиг праймера
Ъ-С=Э
ПЗ--------шя ~Vfe/"
b*
1
пи-
(=>
I—I-------им —пс
стку матрицы и направленных в противоположные стороны по направлению к неизвестным последовательностям, а также одного праймера, соответствующего использованному адаптеру, удается получить продукты ПЦР, большая часть которых составлена неизвестными последовательностями (рис. 26, б). Однако чаще всего реакционная смесь после проведения ПЦР в таких условиях оказывается сильно загрязнена неспецифическими продуктами, которые берут начало от других неспецифических фрагментов ДНК без известной последовательности, фланкированных теми же адаптерами (рис. 26, в).
Повышение специфичности ПЦР в этом случае может быть достигнуто несколькими путями, в том числе, с помощью очистки промежуточных продуктов ПЦР (метод аффинной ПЦР -capture PCR). Для этого праймеры к известной последовательности можно пометить биотином, и меченные таким образом продукты ПЦР отделить от остальных продуктов реакции с помощью аффинной хроматографии на колонках с иммобилизованным стрептавидином. Альтернативно можно не допустить амп-
