Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
К недостаткам этой группы методов следует отнести необходимость проведения очень тщательного дизайна зондов, для каждого из которых требуется проводить определение индивидуальных профилей плавления. Многие зонды такого типа имеют тенденцию к образованию в процессе рефолдинга после тепловой денатурации альтернативных пространственных структур, что сопровождается резким усилением фоновой флуоресценции, со всеми вытекающими отсюда негативными последствиями для чувствительности системы.
Флуоресцентные красители, связывающиеся с ДНК. Четвертый тип систем обнаружения продуктов ПЦР в реальном времени основан на непосредственном взаимодействии флуоресцентных красителей (например, SYBR Green) с дц ДНК [308]. Краситель, не связавшийся с ДНК, обнаруживает слабую флуоресценцию в растворе, которая возрастает в результате связывания красителя дц ДНК по мере элонгации праймеров в цикле ПЦР. На стадии денатурации интенсивность флуоресценции снова уменьшается. В соответствии с этим интенсивность флуоресценции реакционной смеси измеряют в конце этапа элонгации каждого цикла. Хотя метод исключает необходимость в дополнительных флуоресцентных зондах, его специфичность низка и целиком определяется специфичностью взаимодействия праймеров с ДНК-матрицей. Тем не менее, эффективность такой системы можно повысить, фиксируя интенсивность флуоресценции суммарного продукта ПЦР как функцию от температуры плавления (Тм) амп-ликона. Для этого температуру реакционной смеси медленно повышают сверх значений Тм ампликона, фиксируя при этом флуоресценцию, что в ряде случаев позволяет идентифицировать сигнал, исходящий от требуемого продукта ПЦР в виде достаточ-
но
но узкого пика на фоне широких пиков, появляющихся при других температурах, которые относятся к артефактам ПЦР. Вторым недостатком данного метода является зависимость интенсивности флуоресценции от размера продукта ПЦР. Чем больше длина синтезированной ДНК, тем большее количество молекул красителя с ней соединяется.
Праймеры типа “Скорпион”. В одной из последних разработок по обнаружению продуктов ПЦР в реальном времени используются праймеры, которые сами заключают в своей последовательности флуоресцентно меченные зонды [309]. Такие праймеры выполняют двойную функцию: обычную, обеспечивая синтез цепей ДНК, и функцию зонда, которая реализуется после включения праймера в продукт ПЦР. Принцип действия праймеров “Скорпион” представлен на рис. 25, из которого также видно, почему этот класс олигонуклеотидов получил такое экзотическое название. Действительно, графическое изображение праймера в составе продукта ПЦР отчасти напоминает профиль этого отшельника пустыни.
З'-Концевая часть олигонуклеотида “Скорпион” заключает в себе последовательность, комплементарную анализируемому участку ДНК, и в ПЦР выполняет непосредственную роль праймера. 5'-Концевая часть олигонуклеотида сконструирована таким образом, что образует структуру типа “стебель-петля”. За счет этого происходит сближение флуорофора, присоединенного непосредственно к 5'-концу “Скорпиона” с тушителем флуоресценции, расположенным в центральной части олигонуклеотида на границе последовательности праймера. В этом отношении пространственная структура олигонуклеотидов “Скорпион” напоминает таковую “молекулярных маяков” и выполняет ту же функцию - обеспечивает тушение флуоресценции флуорофора до тех пор, пока олигонуклеотиды находятся в свободном состоянии. Однако, в отличие от “молекулярных маяков”, участок ДНК, находящийся в петле “Скорпиона”, комплементарен последовательности нуклеотидов амплифицируемой последовательности ДНК (ампликона), что и обеспечивает ему уникальные свойства. Кроме того, непосредственно за тушителем флуоресценции в цепь ДНК вводится мономер гексэтиленгликоля (HEG), который блокирует прохождение ДНК-полимеразы вдоль матрицы до 5'-конца, т.е. прекращает амплификацию в этой точке, и последовательность, образующая структуру типа “стебель-петля”, остается неамплифицированной.
Во время амплификации праймеры “Скорпион”, как обычно, включаются в продукт ПЦР (рис. 25, а). При прохождении стадий
а
3' 5'
U
5'-
5'-
а^и-3' 5''
Обратная транскрипция
г3'
Денатурация
1
Отжиг
Полимеризация
5'
•5'
¦5'
Тепловая денатурация
$
1VI I I I II I'l'n i I I'l l I I I г
¦3'
¦-
Охлаждение Измерение флуоресценции
г.-------Р
41 Д|Ы|ГI»IIIII1111
I ГП Г'ГП —3'
Тушитель флуоресценции Флуорофор •Ж ПЦР-праймер Блокатор |
