Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Для преодоления затруднения, связанного с низкой точностью синтеза ДНК Taq-полимеразой разработаны варианты ПЦР, которые позволяют амплифицировать протяженные (до 40 т.п.о.) участки ДНК с меньшей частотой включения ошибочных нуклеотидов по сравнению с обычными методами [280]. В таких системах обычно используют смесь двух ДНК-полиме-раз, содержащую укороченный вариант Taq-ДНК-полимеразы (Klentaq), не обладающей 5'—>3'-экзонуклеазной активностью, к которому добавлена 1/160 или 1/500 часть (по единицам активности) Pfu- или Deep Vent-ДНК-полимеразы, соответственно. Два последних фермента обладают 3'—>5 '-корректирующей активностью, что позволяет им удалять нуклеотиды, ошибочно включенные ДНК-полимеразой Klentaq в 3'-конец строящейся цепи ДНК. А это не только способствует более точному синтезу ДНК, но и образованию более длинных продуктов ПЦР.
Метод LA-PCR в настоящее время находит применение в ДНК-диагностике для обнаружения крупных перестроек геномной ДНК, сопровождающихся экспансией тринуклеотидных повторов [281], выявления протяженных транслокаций, а также для амплификации целых генов, например, гена ретинобластомы [282] или вирусных геномов [283].
6.3.8. ПЦР in situ
Этот вариант ПЦР разработан для амплификации последовательностей ДНК или РНК непосредственно на фиксированных препаратах тканей, клеток или хромосом [284, 285]. Если с помощью обычной гибридизации in situ с использованием меченой ДНК в качестве зонда можно обнаруживать до 10 копий анализируемых последовательностей на клетку, то чувствительность ПЦР in situ в -10 раз выше, т.е. позволяет обнаруживать одну ко-
пию ДНК на фоне 1 мкг неспецифической ДНК или (с помощью ОТ-ПЦР) небольшое количество РНК, образовавшейся в результате транскрипции уникального гена. Поскольку метод не требует полного разрушения клеток или тканей, что необходимо для проведения гибридизации по Саузерну или Северного (Northern) блоттинга, с помощью ПЦР in situ удается идентифицировать и локализовать клетки, обладающие исследуемыми последовательностями, и определить их количество.
Постановка ПЦР in situ включает в себя четыре этапа: приготовление и фиксацию препаратов клеток или тканей, получение полупроницаемых клеточных мембран, амплификацию последовательностей с помощью ПЦР и обнаружение ПЦР-продукта. Фиксацию клеток и тканей обычно производят 10%-ным формалином. Далее ткани заключают в парафиновые блоки, а клетки промывают и суспендируют в воде, содержащей диэтилпирокар-бонат, для инактивации ДНКаз и РНКаз. После этого среды тканей и клетки переносят на предметные стекла, обработанные си-ланом, и ткани дополнительно промывают ксиленом и этанолом для удаления парафина. Мембраны клеток делают полупроницаемыми с помощью протеолитических ферментов: пепсина, трипсина или протеиназы К, причем эффективность этой стадии зависит от продолжительности фиксации препаратов формалином. Использование первых двух ферментов предпочтительнее, поскольку они менее стабильны, чем протеиназа К, и легко инактивируются во время инкубации препаратов при высоких значениях pH. Окончательную инактивацию протеиназы проводят с помощью диэтилпирокарбоната и промыванием препаратов абсолютным этанолом. Далее с помощью амплификатора, снабженного специальным блоком, в капле на препарате проводят ПЦР с горячим стартом, используя dUTP, меченный стероидом диокси-генином, или биотином, и по завершению этого этапа препараты инкубируют с антителами к диоксигенину или стрептавидином, находящимися в комплексе с хромогеном, для обнаружения соответствующего комплекса.
6.3.9. Аллель-специфическая ПЦР
Известно, что для эффективного осуществления ПЦР 3-концевой нуклеотид праймера должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду матричной ДНК. В противном случае эффективность удлинения праймера во время ПЦР резко снижается и при определенных сочетаниях ошибочно спаренных нуклеотидов не происходит. Именно эта особенность ПЦР и ле-
Праймер 3
.G-А-С
TTTTG'G'C ^
Ш^-С-С-С-ф-Т-С------
?c
Ш’в-G—C-G—A e=>
-C-C-G-©-T-C----
в
ЧИРЯрР^5
mm
174 п.о.
1 23456789 12345
Рис. 20. Схема одной из современных модификаций аллель-специфиче-ской ПЦР (а), использованной для идентификации точковой мутации FV Leiden в геноме человека (б и в) [286]
Со всеми аллель-специфическими праймерами использован один и тот же встречный праймер. 3'-Концевые нуклеотиды аллель-специфических праймеров комплементарны мутантному нуклеотиду Т (4), нуклеотиду дикого типа С (6), праймер 7 комплементарен нуклеотиду дикого типа своей внутренней частью, а его 3'-концевой нуклеотид не комплементарен матричной ДНК. Для усиления специфичности в праймеры 4 и 6 вблизи 3'-концов введены дополнительные нуклеотиды, некомплементарные матрице. Праймер 4 элонгируется ДНК-полимеразой в присутствии гомозиготной мутантной ДНК, но не ДНК дикого типа (б - дорожки 2 и 3, соответственно), в случае праймеров 6 и 7 наблюдается обратная картина (бив- дорожки 6,8 и 1,3, соответственно). При наличии мутации в гетерозиготном состоянии все праймеры эффективно элонгируются (б - дорожки 5, 9, в - дорожка 4). Увеличение циклов ПЦР сверх оптимального приводит к образованию продуктов ПЦР в тех пробах, где при меньшем числе циклов они не образовывались (б - дорожки 4,7 и в -дорожка 2), что может служить внутренним контролем. Праймер 7 является универсальным, так как позволяет обнаруживать почти любую гомозиготную точковую мутацию, попадающую в его внутреннюю часть. Использование пар праймеров 4 и 6 или 4 и 7 дает возможность дифференцировать гомозиготные и гетерозиготные мутации
