Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Праймер 1 Праймер 2
Мутация Жс-C-G^T^— Мс-с-сф^-
с'С"С_А Х> -гтттС'СчС-С с=>
Дикий ТИП J1LLc-C-G-©-T-C— Жс-С-С-©-Т-С
жит в основе метода обнаружения мутаций с помощью аллель-специфической ПЦР, иногда называемой аллелъ-специфической элонгацией праймера (allele specific primer extension). При исследовании способности Taq-ДНК-полимеразы инициировать синтез ДНК на праймерах, З'-концевой нуклеотид которых некомплементарен матричной ДНК, было установлено, что не все пары ошибочно спаренных нуклеотидов праймера и ДНК-матрицы одинаково эффективно предотвращают синтез ДНК. По способности направлять синтез ДНК все такие пары 3'-концевого нуклеотида праймера и соответствующего нуклеотида матричной ДНК располагаются в следующий ряд: С-С, A-G, G-A, G-G < А-А < Т-С, С-Т, Т-Т « A-С, С-А « G-T, Т-G (данные фирмы “Perkin-Elmer Cetus”). При этом наименее благоприятными для продолжения синтеза ДНК являются пары нуклеотидов пурин-пурин и пиримидин-пиримидин.
На рис. 20 представлены схема высокоэффективного варианта аллель-специфической ПЦР, разработанного нами и использованного для диагностики мутации FV Leiden при тромбофилиях, а также полученные с помощью данного метода результаты [286]. Эта мутация локализована в экзоне 10 гена фактора V системы свертывания крови человека и часто ассоциирована с синдромом ее повышенной свертываемости. В соответствии с последовательностью нуклеотидов анализируемого участка генома синтезируют два праймера, З'-концевой нуклеотид одного из которых комплементарен мутантному нуклеотиду матричной ДНК, а у другого - нуклеотиду дикого типа (см. рис. 20 а, б). Для усиления специфичности действия праймеров вблизи их 3’-концов были введены некомплементарные матрице нуклеотиды. Для исключения ложноотрицательных результатов в пробах, где продукт ПЦР отсутствует, повышали число циклов ПЦР сверх оптимального, после чего, если система работает нормально, продукт ПЦР появляется и в этих пробах, что может служить дополнительным внутренним контролем. Другой тип разработанных нами универсальных аллель-спе-цифических праймеров содержит З'-концевой нуклеотид, всегда некомплементарный матрице, а мутантный нуклеотид матрицы попадает в его внутреннюю часть (рис. 20 а, в). В этом случае продукты ПЦР отсутствуют, если в гибриде во внутреннюю часть праймера попадает любой некомплементарный мутантный нуклеотид матричной ДНК вне зависимости от его точной локализации. Такие праймеры позволяют обнаруживать любые точковые мутации в гомозиготном состоянии и у гаплоидных микроорганизмов.
Для выявления гетерозиготного состояния анализируемого гена иногда используют мутантный и нормальный праймеры раз-
ных размеров, которые различаются по длине их 5'-концевых последовательностей, полностью комплементарных анализируемой ДНК. В этом случае в процессе ПЦР в реакционную смесь можно одновременно добавлять оба аллель-специфических праймера: мутантный и нормальный вместе с общим для обоих праймеров - встречным. Образовавшиеся продукты реакции, соответствующие мутантному аллелю и аллелю дикого типа, далее разделяют электрофоретически в гелях, применяемых для секве-нирования нуклеиновых кислот.
При использовании аллель-специфических праймеров с целью обнаружения мутаций необходимо иметь в виду, что не все сочетания ошибочно спаренных с матрицей 3'-концевых нуклеотидов одинаково эффективны в блокировании ПЦР. Наименьшей способностью к элонгации праймеров с ошибочно спаренными 3'-концевыми нуклеотидами обладает так называемый фрагмент Шоффлера Taq-полимеразы, который представляет собой молекулу ДНК-полимеразы Т. aquaticus, укороченную с N-конца на несколько десятков аминокислотных остатков. В то же время в этом методе не применимы термостабильные ДНК-полимеразы, обладающие 3'—>5 '-корректирующей активностью, например, Vent-полимераза.
ПЦР с аллель-специфическими праймерами является простым и эффективным методом обнаружения мутаций в геномной ДНК обследуемых индивидуумов. В отличие от всех рассмотренных выше методов аллель-специфическая ПЦР в такой постановке позволяет находить небольшое количество мутантных ДНК на фоне большого числа молекул ДНК дикого типа. Аналогичная генетическая ситуация может иметь место в том случае, если соматические мутации возникают в процессе онтогенетического развития организмов, и лишь небольшая часть соматических клеток (клон соматических клеток) таких орга-низмов-мозаиков содержит анализируемые мутации. В этом случае, например, при онкологических заболеваниях, мутантные ДНК в препаратах суммарной ДНК сильно разбавлены соответствующими последовательностями дикого типа и их трудно обнаружить другими методами. Аллель-специфические праймеры, полностью комплементарные лишь мутантным последовательностям анализируемой ДНК, вовлекаются в амплификацию таких мутантных последовательностей, а последовательности нуклеотидов ДНК дикого типа не амплифицируются. Подобный подход позволяет обнаруживать несколько десятков или сотен молекул мутантной ДНК на фоне десятков тысяч молекул ДНК дикого типа.
