Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 26. Использование ПЦР для продвижения вдоль ДНК от участка с известной первичной структурой в сторону неизвестной последовательности [311]
а - молекула ДНК, содержащая в центральной части известную последовательность (пунктирные линии), фланкированную с обеих сторон неизвестными последовательностями (сплошные линии);
б - успешная амплификация неизвестных последовательностей, расположенных рядом с известной;
в - артефакт: амплифицирована неизвестная последовательность, не связанная с известным участком ДНК;
г - амплификация неизвестных последовательностей с использованием очистки промежуточных продуктов ПЦР с помощью биотинилированных праймеров, специфичных в отношении известной последовательности; после синтеза цепей ДНК в первом цикле ПЦР с биотинилированных праймеров, специфичных в отношении известной последовательности, цепи ДНК выделяют с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном стрептавидине и используют в качестве матрицы в ПЦР с праймерами, специфичными в отношении адаптера и известной последовательности. Черные прямоугольники - адаптеры и соответствующие им праймеры, белые прямоугольники - праймеры, комплементарные известным последовательностям;
д - достижение специфичности в амплификации неизвестной последовательности с использованием специального адаптера, который становится доступным праймеру после достройки комплементарной цепи;
е - тот же эффект, достигаемый с использованием “пузырьковой” (bubble)-ПЦР, где а и b - некомплементарные последовательности равной длины, при этом последовательность b идентична таковой далее используемого праймера, Место посадки для которого образуется после синтеза комплементарной цепи, замещающей последовательность а
лификации неспецифических последовательностей, проведя несколько первых циклов ПЦР только в присутствии специфических праймеров, меченных биотином (рис. 26, г). Далее одноцепочечные продукты реакции необходимо очистить с помощью аффинной хроматографии и использовать в качестве матрицы при достройке второй цепи с помощью праймера к адаптеру, а образовавшийся двухцепочечный продукт реакции амплифицировать с использованием праймеров к специфической последовательности и адаптеру.
Еще один вариант решения задачи освобождения от неспецифических продуктов ПЦР предполагает создание матричной последовательности, комплементарной адаптеру, на цепи ДНК, которая синтезируется с праймера, комплементарного известной последовательности (рис. 26, д). При реализации этого принципа концы фрагментов ДНК лигируют с дефосфорилированным адаптером, что предотвращает объединение молекул адаптера друг с другом. Кроме того, адаптер содержит короткий двухцепочечный АТ-богатый участок. По завершении лигирования образовавшиеся молекулы гибридной двухцепочечной ДНК денатурируют и отжигают с праймером, комплементарным известной последовательности анализируемой ДНК, после чего этот праймер используют в качестве затравки для синтеза комплементарной цепи ДНК, на которой создается сайт посадки для встречного универсального праймера, расположенный в адаптере. Далее, в присутствии универсального и специфического праймеров проводят амплификацию исследуемого участка ДНК. По-другому решается та же самая задача методом “пузырьковой” ПЦР (bubble PCR) (рис. 26, е) [312]. Здесь анализируемые фрагменты ДНК лигируют с адаптером, содержащим в центральной части некомплементарные друг другу последовательности а и Ь, из которых b идентична последовательности универсального праймера. Свое название метод получил из-за того, что некомплементарные одноцепочечные участки формируют структуру, напоминающую вздутие или пузырек. После лигирования, денатурации и отжига специфического праймера с достраивают комплементарную цепь, которая содержит сайт посадки универсального праймера, после чего амплифицируют анализируемый участок ДНК в присутствии двух праймеров Ъ и с.
В заключение этого раздела следует упомянуть еще об одном простом и эффективном способе исследования участков ДНК с неизвестной первичной структурой, расположенных в окрестностях короткой известной последовательности, с помощью обратной или инвертированной ПЦР (inverse PCR) [313] (рис. 27). В этом
Рестрикция
Лигирование при низкой концентрации ДНК
О-
ПУ
Амплификация
рис. 27. Обратная (инвертированная) ПЦР [311]
Пунктирная линия обозначает известную последовательность, прямоугольники - праймеры, а стрелки рядом с ними - направление синтеза ДНК
случае исследуемый препарат инкубируют с рестриктазой для получения комплементарных друг другу липких концов, образовавшиеся фрагменты разбавляют до очень низкой концентрации и лигируют. В таких условиях фрагментны преимущественно замыкаются в кольцо, а не объединяются в линейные молекулы. Только кольцевые молекулы далее направляют образование продукта ПЦР при использовании неочищенного продукта лигирования в качестве матрицы при проведении ПЦР в присутствии праймеров, комплементарных известной последовательности и направленных в противоположные стороны. По завершении амплификации образуется продукт ПЦР в виде линейной двухцепочечной ДНК, содержащий объединенную по сайту рестрикции неизвестную последовательность, фланкированную с двух сторон последовательностями известной первичной структуры. Эффективность амплификации можно повысить, если перед проведением ПЦР кольцевые молекулы линеаризовать по сайту рестрикции, искусственно созданному между сайтами посадки двух праймеров.
