Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
тарного избыточной 5’-концевой последовательности праймеров. Первые циклы ПЦР проводят при температуре отжига праймеров, которая обеспечивает амплификацию соответствующего участка матрицы. Затем температуру отжига повышают, что дает возможность лишь третьему праймеру взаимодействовать с дополнительной последовательностью на концах первых двух. В результате образовавшиеся в предыдущих циклах продукты ПЦР продолжают амплифицироваться только с помощью этого одного праймера. С помощью такого подхода удается повысить специфичность ПЦР и избежать образования димеров праймеров, поскольку короткие продукты ПЦР из-за присутствия на их концах самокомплементарных последовательностей образуют структуры типа “ручки сковородки” (шпилька-одноце-почечная петля). ДНК с подобными структурами являются при проведении ПЦР плохими матрицами.
6.3.6. ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией
Метод ПЦР, сопряженной с обратной транскрипций (ОТ-ПЦР) (RT PCR, one tube PCR), позволяет обнаруживать в образцах последовательности РНК и количественно определять их содержание, что широко используется для оценки дифференциальной экспрессии генов на уровне транскрипции и в ДНК-диа-гностике возбудителей инфекционных заболеваний, например, для обнаружения вируса гепатита С или ВИЧ [279]. Во время проведения ОТ-ПЦР на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезируют кДНК, последовательности которой далее, в свою очередь, амплифицируют в обычной ПЦР. В современных вариантах ОТ-ПЦР (обратную транскрипцию и ПЦР) проводят в одной пробирке, что объясняет одно из распространенных названий этого метода [263].
Для проведения обратной транскрипции используется несколько ферментов. Наиболее эффективной (но и дорогостоящей) является обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц (AMV), с помощью которой удается синтезировать кДНК длиной до 14 т.п.о., вируса лейкоза мышей Молони (MMLV) (10 т.п.о.), а также ДНК-полимеразы термофильных бактерий Thermus thermophilus (Tth-ДНК-полимераза), Т. flavus и Carboxydothermus hydrogenoformans (С. therm.), с помощью которых удается амплифицировать последовательности меньшей длины (до 3 т.п.о.). Бактериальные ДНК-полимеразы обнаруживают способность использовать РНК в качестве матриц только в присутствии ионов Мп2+ (кроме С. therm., которая активна в присутст-
вии ионов Mg2+) при повышенной температуре (50-70°С), что особенно удобно в случае амплификации последовательностей с высоким GC-составом и сложной вторичной структурой. Вариант метода с раздельной обратной транскрипцией и ПЦР подходит для исследования сложных смесей РНК или при необходимости транскрибирования очень длинных последовательностей. В данном случае обратную транскрипцию проводят в условиях, полностью оптимизированных для этих ферментов, чего не удается сделать при проведении обеих стадий реакции в одной пробирке.
Ввиду чрезвычайно высокой чувствительности метода источником ложноположительных результатов могут быть даже небольшие примеси ДНК в анализируемых образцах. Проблему решают путем подбора праймеров таким образом, чтобы они были комплементарны последовательностям соседних экзонов. В этом случае продукт ПЦР не образуется на матрице ДНК из-за большого размера интрона, если же он все-таки синтезируется, его можно будет легко отличить по размерам от ожидаемого фрагмента ДНК, который должен синтезироваться на безин-тронной матрице кДНК. Альтернативным способом борьбы с такими артефактами является обработка анализируемых образцов ДНКазой.
6.3.7. Амплификация больших участков ДНК
с высокой точностью
Имеется несколько факторов, ограничивающих в обычных условиях проведение амплификации протяженных последовательностей ДНК с высокой точностью (long PCR, long and accurate (LA) PCR). Среди них следует упомянуть депуринизацию ДНК при высоких температурах, используемых для денатурации ДНК, подавление элонгации растущих цепей ДНК стабильными элементами вторичной структуры амплифицируемых одноцепочечных участков матрицы, слишком короткое время элонгации праймеров в соответствующих сегментах ПЦР или фрагментация матричной ДНК. Первое затруднение удается частично преодолевать путем повышения значений pH реакционной смеси при проведении ПЦР, что подавляет протонирование пуриновых оснований, которое само по себе ускоряет процесс депуринизации. Проблема вторичной структуры матрицы может быть решена включением в состав реакционной смеси денатурирующих агентов типа диметилсульфоксида, а третье затруднение - увеличением продолжительности элонгации праймеров при температуре 72°С. Образование двухцепочечных разрывов матрицы можно
предотвратить, выделяя ДНК в более мягких условиях, в том числе и электрофорезом в импульсном электрическом поле. Однако наиболее серьезным фактором, ограничивающим возможность амплификации протяженных участков ДНК-матрицы, является низкая точность синтеза ДНК очищенными термостабильными ДНК-полимеразами, у которых, как уже упоминалось, отсутствует 3' —> 5'-экзонуклеазная корректирующая активность. Нуклеотиды, ошибочно включенные в продукт ПЦР, резко увеличивают вероятность терминации синтеза ДНК в этой точке и обрыва строящейся цепи ДНК. Такая преждевременная терминация синтеза ДНК полностью предотвращает амплификации участков ДНК, длина которых превышает 5-10 т.п.о.
