Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 8
Частота ошибок при синтезе ДНК, осуществляемом термостабильными ДНК-полимеразами при проведении ПЦР в оптимальных условиях
Д Н К-пол имераза Частота мутаций
(на 1 нуклеотид/1 раунд репликации)
Pfu 1,3 • КГ6
Deep Vent 2,7 • КГ6
Vent 2,8 • КГ6
Taq 8,0 • 10-6
exo(-)Pfu и UITma 5,0 • 10"5
Смесь Taq/Pfu или Klentaq/Pfu -5,0 • 10-6
теме. Частота ошибочно включенных нуклеотидов в результате одновременного функционирования двух разных ДНК-полиме-раз в смесях, применяемых для амплификации длинных сегментов ДНК (long PCR), оказывается ниже, чем при использовании Taq-полимеразы, но выше, чем для очищенной ДНК-полимеразы Pfu (табл. 8).
Мутации, которые возникают при использовании Taq-ДНК-полимеразы, как правило, представляют собой транзиции АТ GC. В том случае, если матрица обладает тенденцией к образованию элементов вторичной структуры, возникновение де-леций также становится весьма вероятным [263]. Klentaq, мутант Taq-ДНК-полимеразы, у которого отсутствует 5’ -» З’-экзонук-леазная активность из-за делеции N-концевой части полипептидной цепи, получил свое название по аналогии с фрагментом Клёнова ДНК-полимеразы IЕ. coli, у которого по той же причине отсутствует эта активность, присущая ферменту дикого типа. В отличие от Taq-ДНК-полимеразы Klentaq обладает более широким оптимумом в отношении концентрации ионов Mg2+, что позволяет осуществлять эффективный поиск оптимальных условий проведения реакции, при изменении других компонентов реакционной смеси. В смеси с ферментами, обладающими корректирующей экзонуклеазной активностью, его часто используют для амплификации протяженных участков ДНК. Приблизительно теми же свойствами обладает фрагмент Штоффеля Taq-ДНК-полимеразы, который представляет собой фрагмент С-концевой части ее полипептидной цепи длиной в 544 а.о.
Tth-ДНК-полимераза, выделенная из термофильной бактерии Thermus thermophilus, обладает в присутствии ионов Мп2+ активностью РНК-зависимой ДНК-полимеразы, а в присутствии
ионов Mg2+ активностью обычной ДНК-полимеразы, сравнимой с таковой у Taq-ДНК-полимеразы. Благодаря этим свойствам фермент используется для одновременного проведения обратной транскрипции и амплификации транскрибированных последовательностей в одной пробирке.
Pfu-ДНК-полимераза из Pyrococcus furiosus обладает высокой термостабильностью, 3' -» 5'-корректирующей экзонуклеазной активностью, и, как следствие, высокой точностью синтеза ДНК. При использовании в смеси Taq-ДНК-полимеразы она обеспечивает образование продуктов ПЦР с тупыми концами, поскольку 3’-выступающий А отщепляется экзонуклеазой Pfu-ДНК-поли-меразы.
Vent-ДНК-полимераза из Thermococcus litoralis по многим свойствам напоминает Pfu-полимеразу, однако, в отличие от нее, этот фермент неспособен амплифицировать матрицы, если в них присутствуют остатки I или dU.
Deep Vent-ДНК-полимераза из Pyrococcus species GB-D в отличие от только что рассмотренного фермента более устойчива к присутствию формамида и диметилсульфоксида в реакционной смеси, которые используются для понижения температуры плавления амплифицируемых участков ДНК, обладающих высоким GC-составом и сложной вторичной структурой. С помощью этого фермента удается амплифицировать участки ДНК по крайней мере до 14 т.п.о.
UlTma-ДНК-полимераза из Thermotoga maritima применяется для амплификации участков ДНК, длина которых не превышает 3 т.п.о. Как и в случае всех остальных ДНК-полимераз, обладающих 3 '—>5'-корректирующей активностью, под действием UlTma-ДНК-полимеразы образуются продукты ПЦР, не содержащие 3'-выступающих А, и, следовательно, эти продукты могут быть непосредственно использованы для клонирования по тупым концам. Все приведенные здесь данные взяты из руководства [263].
Прежде чем закончить раздел о ДНК-полимеразах, применяемых в ПЦР, хочется дать небольшой комментарий по поводу концентраций ферментов в пробах, которые целесообразно применять при проведении реакции. В рутинных экспериментах в пробы объемом 25-100 мкл обычно добавляют 0,5-0,25 ед. фермента. Вообще, чем выше концентрация фермента в пробе, тем больше вероятность образования неспецифических продуктов. В то же время необходимо помнить, что амплификация, осуществляемая, в частности, Taq-ДНК-полимеразой, происходит по дистрибутивному механизму, т.е. в процессе синтеза особенно
длинных цепей ДНК фермент, начавший синтез, редко его заканчивает. Происходит диссоциация комплекса фермент-(про-дукт-матрица), и синтез продолжает новая молекула фермента. Исходя из этого, очевидно, что для получения продуктов ПЦР большой длины необходимо повышать концентрацию фермента в пробе вплоть до 10 ед. активности на 50 мкл реакционной смеси. В эффективности такого незамысловатого приема приходилось неоднократно убеждаться на практике.
