Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Дискретные “неспецифические” продукты. Исследование этого феномена в каждом случае требует индивидуального подхода. Например, по нашему опыту амплификация генетических локусов, содержащих повторяющиеся последовательности, может сопровождаться образованием нескольких воспроизводимых дискретных полос, которые не отражают гетерогенности длин исследуемого участка ДНК в геноме. Амплификация индивидуального клонированного продукта ПЦР в данном случае приводит к образованию точно тех же дискретных продуктов. Это указывает на то, что сам продукт ПЦР, образовавшийся в первых циклах, формирует гетерогенную матрицу. Конечно, причиной появления дискретных неспецифических полос могут быть и бо-
лее тривиальные факторы, связанные с неоптимальными условиями проведения ПЦР.
Высокомолекулярный “шмир” на фоне дискретных продуктов ПЦР или при полном их отсутствии. “Шмир” очень часто возникает при использовании плохо очищенных матриц. При появлении “шмира” светится вся дорожка в агарозном геле после проведения электрофореза и окрашивания его бромистым этидием. В этом случае имеют место множественные неспецифические инициации синтеза ДНК из-за присутствия в реакционной смеси низкомолекулярных затравок в виде неспецифических фрагментов ДНК или РНК, а также повторяющихся последовательностей в матрице, которые “залипают” друг на друга. Денатурированные белки, неспецифически удерживая концы фрагментов ДНК вблизи матрицы, могут создавать места множественной инициации синтеза ДНК и т.п. Имеются, по крайней мере, две возможности преодоления такого эффекта: дополнительная очистка матрицы, например, с помощью фенольной депротеинизации или с использованием ионообменной смолы Chelex-100 [270], а также, если по каким-то причинам хорошо очищенные матрицы недоступны, применение модифицированных ДНК-полимераз в ПЦР с “горячим стартом” (см. ниже).
6.2.2. Низкий выход или полное отсутствие продуктов ПЦР
В сильно неоптимальных условиях ПЦР не происходит. При наличии такого результата необходимо убедиться в том, что амп-лификатор работает правильно, проверить (путем последовательной замены на работающие) все компоненты реакционной смеси, попытаться резко понизить температуру отжига праймеров или снова выделить ДНК.
Однако, в том случае, если для выделения нуклеиновых кислот используются упрощенные и ускоренные методы, что неизбежно при проведении массовых анализов в клинических лабораториях, оценке качества пищевых продуктов или мониторинге окружающей среды, причиной отсутствия продуктов ПЦР в реакционной смеси могут быть многочисленные ингибиторы реакции. Подробные данные о таких ингибиторах, а также стимуляторах ПЦР, можно найти в специальном обзоре [271].
6.3. Методы ПЦР
6.3.1. Стандартная ПЦР
В простых случаях подходы, основанные на протоколах стандартной ПЦР, разработанные К.Б. Мюллисом и др., как правило, дают хорошие результаты при амплификации последовательностей, длина которых не превышает 3 т.п.о. Такой метод наиболее применим для амплификации коротких последовательностей, любых последовательностей в составе гомогенных векторных молекул на основе плазмид и хромосом бактериофагов, а также при реамплификации продуктов ПЦР. В этом случае точное следование прописи является гарантией получения нужного ПЦР-продукта.
6.3.2. Множественная ПЦР
Присутствие в реакционной смеси нескольких пар праймеров, специфичных в отношении разных генетических локусов, в ряде случаев позволяет проводить одновременную амплификацию соответствующих участков ДНК-матрицы. Такой вариант системы ПЦР получил название множественной ПЦР (мПЦР). (multiplex PCR, mPCR). В простом случае это становится возможным, если оптимальные условия проведения реакции близки для всех пар используемых праймеров. Если мПЦР проводят в формате аллель-специфической ПЦР (см. раздел 6.3.11 этой главы), и целью эксперимента является одновременная идентификация двух аллелей одного гена, которые различаются по одному нуклеотиду, то аллель-специфические праймеры делают разной длины, что позволяет по размеру продуктов ПЦР, разделяемых с помощью капиллярного электрофореза, идентифицировать исследуемые аллели.
6.3.3. Асимметричная ПЦР
Асимметричная ПЦР (asymmetrical PCR), иначе называемая однонаправленной ПЦР (single-sided PCR), используется Для наработки одноцепочечных фрагментов ДНК, соответствующих амплифицируемому участку ДНК-матрицы. В этом случае при постановке ПЦР один из праймеров находится в низкой концентрации, поэтому в процессе ПЦР он быстро истощается, и синтез ДНК с этого момента продолжается с одного праймера, исходно присутствовавшего в избытке, а накопление ПЦР-продукта уже происходит не экспоненциально, а ли-
нейно. В итоге продукт ПЦР оказывается представленным, в основном, одноцепочечными молекулами ДНК. Кроме вышеупомянутого случая с множественной ПЦР, асимметричную ПЦР используют также для проведения непосредственного секвенирования продукта ПЦР [272], для наработки одноцепочечных ДНК при создании олигонуклеотидных микрочипов [273] и в других приложениях (например, при исследовании полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (single-stranded conformation polymorphism - SSCP) в ДНК-диагностике, требующих для своей реализации использования оцДНК.
