Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
- при выборе мест отжига праймеров на матрице необходимо избегать участков, которые в одноцепочечной форме образуют вторичную структуру, например, палиндромных последовательностей, особенно в том случае, если Тт этих участков больше Та праймеров;
- по мере необходимости допускается присоединение к 5-концам праймеров некомплементарных матрице последовательности, которые могут заключать в себе требуемые сайты рестрикции, промоторные участки, кодоны инициации и терминации трансляции и т.п.;
- для эффективной ПЦР не требуется полной комплементарнос-ти праймеров матрице, хотя полное соответствие желательно;
- для исключения отжига праймеров в неспецифических местах анализируемых последовательностей, необходимо подтвер-
дить с помощью компьютерного анализа отсутствие в них дополнительных мест посадки. Это особенно важно при анализе таких больших геномов как геном человека, животных и растений. Практически подобный анализ проводят с использованием баз данных последовательностей исследуемого организма, доступных через Интернет. Необходимо изменять последовательность праймеров в том случае, если их гомология с возможными вторичными сайтами посадки превышает 70%. При этом использование интронных последовательностей в качестве мест посадки дает хороший результат, поскольку они, как правило, дивергированы даже в мультигенных семействах;
- полезно начинать и заканчивать последовательность праймера с одного-двух пуриновых нуклеотидов, однако следует избегать включения остатков G или С на его 3'-конец, так как это повышает вероятность неспецифического отжига праймеров из-за высокой прочности соответствующих водородных связей;
- недопустима самокомплементарность праймеров, особенно в их 3’-концевых областях. Ее наличие способствует амплификации димеров праймеров, а протяженная самокомплементарность делает праймеры нефункциональными;
- при амплификации последовательностей в мультигенных семействах, когда не удается сделать праймеры полностью специфичными для одного локуса, необходимо приложить усилия, чтобы по крайней мере два (чем больше, тем лучше) последних 3-концевых нуклеотида были полностью специфичны в отношении анализируемого участка ДНК. Таким простым приемом часто удается предотвратить появление неспецифических продуктов ПЦР в этих сложных специальных случаях;
- ионные условия при проведении ПЦР и количество циклов должны определяться индивидуально для каждой новой пары праймеров;
- стандартные концентрации праймеров в реакционной смеси составляют 0,1-1,0 мкМ, хотя в большинстве случаев хорошие результаты получаются при их концентрациях 0,2-0,5 мкМ. При этом необходимо иметь в виду, что чем больше концентрация праймеров в реакционной смеси, тем выше вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и тем дороже обходится каждая проба. В этой связи минимальные концентрации праймеров для конкретных условий проведения реакции должны быть определены эмпирически. Однако для повышения эффективности ПЦР, когда вышеупомянутый критерий не является критическим (например, при амплификации плазмидной ДНК), необходимо увеличивать соотношение праймер/матрица.
Осуществление дизайна праймеров в настоящее время сильно облегчается наличием высокоэффективных пакетов программного обеспечения, которые созданы специально для этой цели. Но ни одна из современных компьютерных программ не освобождает исследователя от необходимости затраты интеллектуальных усилий при попытке решения собственных проблем.
6.1.4. Термостабильные ДНК-зависимые ДНК-полимеразы
Другим важнейшим компонентом реакционной смеси при проведении ПЦР является термостабильная ДНК-полимераза. В настоящее время, благодаря наличию высокоразвитой дилерской сети, имеется много источников разных термостабильных ДНК-полимераз, хотя, как это обычно бывает, первичных производителей этих ферментов намного меньше. Поэтому разнообразие доступных препаратов ферментов не так велико, как кажется на первый взгляд.
Выбор конкретной ДНК-полимеразы зависит от целей эксперимента. Ферменты, обладающие более высокой точностью синтеза ДНК, и меньшей частотой включения в продукт ПЦР ошибочных (некомплементарных матрице) нуклеотидов, как правило, обладают 3' -» 5'-экзонуклеазной (корректирующей) активностью. В том случае, если на 3'-конец строящейся цепи ДНК включается некомплементарный матрице нуклеотид, он удаляется из цепи с участием этой активности ДНК-полимеразы. К сожалению, наиболее широко распространенная в настоящее время Taq-ДНК-полимераза, такой активностью не обладает, а следовательно, точность синтеза ДНК этим ферментом невелика по сравнению с ДНК-полимеразами, способными корректировать собственные ошибки. К последним ферментам относятся, например, Pfu-, Vent- и Deep Vent-ДНК-полимеразы.
Несмотря на более высокую точность действия этих ферментов, только с ними не работают по ряду причин. Основная из них - неспецифический гидролиз праймеров, который происходит под действием корректирующей экзонуклеазы. При этом, чем длиннее праймер, тем выше начальная скорость его деградации. Кроме того, точности работы Taq-ДНК-полимеразы оказывается вполне достаточно для большей части экспериментов, в которых она используется в настоящее время. Тем не менее, точность Taq-полимеразы можно повысить, если ее применять в составе смесей с более корректно работающими ферментами (-50:1), что позволяет уменьшить скорость деградации праймеров и значительно повысить точность синтеза ДНК во всей сис-
