Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
6.1.5. Другие критические компоненты и параметры ПЦР
Матричные нуклеиновые кислоты. В обычных опытах в пробы добавляют 102-105 копий матрицы. При уменьшении концентрации матрицы до уровня ниже оптимального возрастает вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР. Понижением отношения праймер/матрица добиваются увеличения специфичности реакции, в то же время с увеличением этого отношения, как правило, происходит возрастание количества образовавшегося продукта.
Ионы двухвалентных металлов. Концентрация ионов Mg2+ должна превышать концентрацию дезоксирибонуклеозидтрифо-сфатов (dNTPs) в реакционной смеси на 0,5-3,0 мМ. Такой избыток необходим потому, что основным источником фосфатных групп во время ПЦР являются dNTPs, а ионы Mg2+ образуют с ними растворимый комплекс. В то же время ионы взаимодействуют еще и с матричной ДНК, праймерами, самой ДНК-полимеразой и являются абсолютно необходимыми для функционирования любых ферментов матричного синтеза нуклеиновых кислот. Их концентрация влияет на процесс отжига праймеров, температуру плавления двойной спирали нуклеиновых кислот, активность и точность функционирования ДНК-полимеразы. В этой связи, требуется точное определение оптимальной концентрации ионов Mg2+ в реакционной смеси для каждого нового сочетания праймеров и матрицы. В общем, повышение концентрации ионов Mg2+ выше оптимальной уменьшает специфичность ПЦР, что часто сопровождается образованием “шмира”.
Температурный режим. Первому циклу ПЦР обычно должна предшествовать преинкубация реакционной смеси при 92-96°С в течение 0,5-10 мин, что сопровождается инактивацией примесных белков, если они там присутствуют, а также способствует более полной первоначальной денатурации матричной ДНК. Введение этого этапа повышает эффективность ПЦР. При завершении последнего цикла пробы обычно выдерживают в тече-
ние 5-10 мин при 72°С для полного завершения синтеза начавших синтезироваться цепей в ПЦР-продукте. Необходимость такой задержки именно на последнем этапе синтеза ДНК связана с тем, что к этому моменту накапливается большое количество продукта ПЦР, и незавершенность синтеза его цепей особенно сильно проявится в гетерогенности состава молекул реакционной смеси. В то же время недостроенные молекулы, остающиеся в промежуточных циклах, достраиваются сами собой и не оказывают влияния на общий результат реакции.
Время элонгации праймеров. Скорость элонгации праймеров при ПЦР обычно приближается к 50 нт/сек при 72°С. Из этого следует, что для амплификации участка матрицы длиной < 400 нт вполне достаточно 15 сек. Это время можно сократить еще больше, поскольку процесс элонгации праймеров начинается уже в фазе их отжига. В случае амплификации очень длинных последовательностей время элонгации следует увеличивать в ходе ПЦР с целью компенсации ингибирующего влияния возрастающей вязкости реакционной смеси.
Циклы. Количество циклов, которое необходимо провести для амплификации требуемой последовательности, обратно пропорционально количеству копий матрицы в реакционной смеси. Обычно используют такое число копий, чтобы видимый продукт образовывался после проведения 25-50 циклов. Во время ПЦР наблюдается экспоненциальная фаза увеличения числа синтезированных молекул дцДНК, которая продолжается до тех пор, пока это число не достигнет -1012. Затем скорость накопления продукта резко уменьшается. Существует несколько основных факторов, которые препятствуют экспоненциальному накоплению продукта, как это должно происходить теоретически. Из них следует упомянуть истощение субстратов реакции (праймеров или dNTPs), стабильность компонентов реакционной смеси, ингибирование ПЦР конечным продуктом реакции, конкуренцию за субстраты неспецифическими продуктами ПЦР или димерами праймеров, повторный отжиг продуктов ПЦР, препятствующий элонгации праймеров, неполную денатурацию в присутствии большого количества продукта ПЦР и ряд других. С учетом этих факторов из-за “эффекта плато” увеличение числа циклов само по себе не приводит к возрастанию специфичности ПЦР или накоплению специфического продукта. Для повышения специфичности ПЦР необходимо понижать число циклов и уменьшать продолжительность их отдельных сегментов (время денатурации, отжига и элонгации праймеров). Однако для повышения эффективности ПЦР при амплификации больших участков матрицы
(>1 т.п.о.) продолжительность сегментов ПЦР в каждом цикле нужно увеличивать. На продолжительность отдельных сегментов циклов оказывают влияние форма капли реакционной смеси, толщина стенок пробирок, а также особенности конструкции нагревающего блока амплификатора (термоциклера).
Объем реакционной смеси. Стандартный объем пробы, в которой проводят ПЦР, обычно составляет 20-100 мкл, тем не менее, при использовании современных амплификаторов для аналитических целей может вполне подойти объем в 5 мкл. Пробы большого объема неэффективно прогреваются и охлаждаются, в маленьких объемах синтезируется небольшое количество ПЦР-продукта.
6.2. Проблемы, возникающие при постановке ПЦР
