Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
5.4.2. Эукариотические системы
Несмотря на относительную простоту получения бактериальных белоксинтезирующих систем, их использование ограничивается трансляцией бактериальных и фаговых мРНК или рекомбинантных последовательностей нуклеотидов, находящихся под контролем генетических регуляторных элементов бактерий или бактериофагов. В этой связи возникла необходимость в разработке бесклеточных систем биосинтеза белка, пригодных для непосредственной трансляции мРНК высших организмов.
В настоящее время наиболее часто применяемыми системами такого рода являются белоксинтезирующие системы из ретику-лоцитов кроликов, зародышей пшеницы и культивируемых соматических клеток различного происхождения. При этом системы всех трех типов могут быть использованы почти с одинаковым успехом для трансляции разнообразных мРНК и, как правило, такие системы не обнаруживают видоспецифичности. Основные принципы конструирования прокариотических белоксинтезирующих систем применяют и для получения систем биосинтеза белков высших организмов. Специфика последних связана, прежде всего, с биологическими особенностями объектов, которые служат источником белковых компонентов систем, а также с различиями механизмов биосинтеза белка у прокариот и эукариот.
Ретикулоциты - безъядерные предшественники эритроцитов человека и животных, осуществляют активный синтез гемоглобина и в связи с этим обладают всеми необходимыми компонентами белкового синтеза. В то же время отсутствие ядер в таких клетках дает возможность получать бесклеточные экстракты,
минимально загрязненные геномной ДНК. Эти особенности ре-тикулоцитов животных делают их излюбленным источником бесклеточных экстрактов, способных осуществлять эффективную трансляцию разнообразных экзогенных мРНК.
Все основные компоненты, необходимые для функционирования бактериальных бесклеточных систем биосинтеза белка, должны присутствовать и в бесклеточной белоксинтезирующей системе из ретикулоцитов кроликов. Однако необходимо отметить две существенные особенности такой системы. Во-первых, для регенерации АТР в качестве доноров фосфатных групп используют креатинфосфат - универсальный аккумулятор энергии в макроэргических связях у большинства позвоночных, а сам перенос групп осуществляется вводимой в систему креатинфосфо-киназой. Во-вторых, для предотвращения ингибирования трансляции в процессе синтеза белка в систему вводят гемин.
Функционирование системы из зародышей пшеницы и ее состав существенно не отличаются от таковых ретикулоцитарной системы биосинтеза белка. Различия заключаются, главным образом, в методах получения бесклеточных экстрактов. Зародыши обычно выделяют из сухих зерен озимой пшеницы. Преимуществами этих бесклеточных белоксинтезирующих систем перед другими являются возможность длительного хранения и доступность исходного биологического материала (зерен сортовой пшеницы), что обеспечивает воспроизводимость получаемых результатов и не требует проведения экспериментов с лабораторными животными.
Несмотря на то, что разные эукариотические бесклеточные белоксинтезирующие системы активно транслируют гетероло-гичные мРНК, гомологичные матрицы, как правило, транслируются более эффективно. Например, глобиновые мРНК используются в синтезе белка в семь-восемь раз лучше лизатами ретикулоцитов, чем экстрактами культивируемых клеток яичников китайских хомячков. Кроме того, в клетках разных типов дифференцированных тканей могут присутствовать специфические белковые ингибиторы трансляции определенных мРНК. Факты такого рода необходимо учитывать при выборе бесклеточной системы для решения конкретных экспериментальных задач.
5.4.3. Проточные системы
Бесклеточные системы биосинтеза белка позволили генной инженерии получать экспрессию изолированных генов, не прибегая к помощи живых клеток. До недавнего времени все обсуждавшиеся выше бесклеточные системы существовали только в
аналитическом варианте и были функционально активны на протяжении короткого времени (40-60 мин). Для всех этих систем характерен малый выход синтезируемого белка (не более 1 мкг на 1 мл экстракта), и на одну молекулу мРНК в них синтезируется лишь одна-две молекулы полипептида.
Значительный прогресс в этой области исследований был достигнут в лаборатории А.С. Спирина в 1988 г. С помощью простых усовершенствований удалось получить эффективную бес-клеточную белоксинтезирующую систему. Бесклеточные экстракты бактериальных или эукариотических клеток помещают в ячейку, закрытую с двух сторон полупроницаемыми мембранами. Размер пор позволяет проходить через мембраны вместе с током жидкости низкомолекулярным химическим веществам и небольшим белкам. Содержимое ячейки, в которой имеются все компоненты, необходимые для бесклеточной трансляции, инкубируют при обычной температуре. При этом с одной стороны в такую ячейку-реактор со скоростью ~1 мл/ч непрерывно поступают ингредиенты, расходуемые в процессе биосинтеза белка (аминокислоты, ATP, GTP), а с другой - из нее выходят синтезированные белковые продукты (если их молекулярная масса и отсутствие способности к агрегации позволяют пройти через поры мембраны).
