Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 73

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 67 68 69 70 71 72 < 73 > 74 75 76 77 78 79 .. 221 >> Следующая

5.2.2. Клетки мышиной миеломы (линия SP2/0)
Клетки миеломы находят широкое применение для получения гибридом - линий клеток, производящих моноклональные антитела определенной специфичности. Поскольку эти клетки осуществляют эффективную секрецию рекомбинантных белков, они хорошо изучены в отношении экспрессии в них соответствующих рекомбинантных генов, введенных с помощью трансфекции. Кроме того, такие клетки способны расти в суспензионной культуре (без прикрепления к поверхности субстрата), что облегчает их культивирование при необходимости крупномасштабной наработки.
Линия клеток мышиной миеломы Sp2/0 Agl4, утративших способность синтезировать или секретировать иммуноглобулины, часто используется для производства рекомбинантных белков. Клетки этой линии легко трансфецируемы рекомбинантными ДНК и могут выращиваться в больших количествах на питательной среде без дорогостоящей сыворотки. Клетки Sp2/0 экспрессируют эндогенный ген ДГФР, что делает невозможным их прямое применение для амплификации рекомбинантных ДНК с использованием метотрексата. Это затруднение обычно преодолевают путем введения в экспрессирующий вектор мутантного гена ДГФР, в котором точковая мутация, сопровождаемая заменой Т —> G, приводит к замещению Leu —> Arg в положении 22 полипептидной цепи ДГФР, следствием чего является понижение сродства фермента к метотрексату в 270 раз. Благодаря этому после трансфекции может быть проведен отбор клеток, содержащих мутантный ген ДГФР вместо нормального, путем постепенного увеличения концентрации метотрексата в среде. При умеренных
концентрациях ингибитора эндогенный ген ДГФР полностью инактивируется, тогда как мутантный ген остается активным и может быть амплифицирован в результате описанного выше механизма после повышения концентрации метотрексата в среде. Однако уровень амплификации гена ДГФР и ассоциированного с ним рекомбинантного гена в такой системе, как правило, ниже, чем в обычной, так как меньшее число внутриклеточных копий мутантного гена требуется для обеспечения необходимого уровня устойчивости клеток к ингибитору. Кроме того, было показано, что высокий уровень внутриклеточной экспрессии рекомбинантных генов, введенных в клетки Sp2/0 с помощью трансфекции, может обеспечиваться после инкубации с метотрексатом за счет увеличения скорости их транскрипции, а не в результате их амплификации. Такой результат может быть получен в результате введения множественных копий гена ДГФР при трансфекции. Структура одного из векторов, пригодного для использования с миеломными клетками Sp2/0, представлена на рис. 17, б. Транскрипция трансгенов в этом векторе обеспечивается промоторно-энхансерными элементами гена иммуноглобулина с участием эндогенных регуляторных факторов клеток миеломы.
5.2.3. Клетки селезенки мышей (линия MEL)
Обе системы экспрессии, описанные выше, базируются на амплификации трансгенов, обеспечивающей высокий уровень внутриклеточного синтеза кодируемых ими рекомбинантных белков в отобранных клонах клеток. Тем не менее, в природе уникальные гены (т.е. присутствующие в виде одной копии на гаплоидный геном) могут экспрессироваться с очень высокой эффективностью. Примером этого являются, например, иммуноглобулины, секретируемые плазматическими клетками, или глобины, синтезируемые в больших количествах клетками эри-троидного ряда. Высокий уровень транскрипции глобинового локуса становится возможным не только благодаря функционированию эффективных промотора и энхансера, но и в результате присутствия так называемой доминантной регуляторной области (dominant control region - DCR), изменяющей пространственную структуру хроматина всего локуса. DCR расположена за ~50 т.п.о. перед кластером глобиновых генов и вначале была идентифицирована благодаря присутствию в ней нескольких сайтов, гиперчувствительных к ДНКазе. Путем комбинирования последовательностей нуклеотидов, окружающих сайты, удалось сконструировать небольшую искусственную DCR, об-
ладающую всеми основными свойствами исходной. Рекомбинантные гены, объединенные в векторе с такой DCR, экспрессировались с высокой эффективностью в клетках эритроидно-го ряда независимо от места их интеграции в геном и не требовали для этого предварительной амплификации. Таким образом, рассматриваемая система позволяет избежать отрицательного влияния эффекта положения у рекомбинантных генов, что избавляет от необходимости скрининга большого числа транс-фецированных клеток для получения высокопродуктивных продуцентов рекомбинантных белков.
Для биотехнологических целей в настоящее время часто используется линия клеток MEL-E9, которая является производной линии клеток MEL-NP5, полученных из селезенки мышей NFS, зараженных дефектным по репликации вирусом, образующим фокусы селезенки (spleen focus forming virus - SSFV). Эти клетки не образуют вирусных частиц, но вызывают возникновение опухолей после инъекции сингенным мышам. Они не претерпевают спонтанной дифференцировки, однако, под действием экзогенных факторов (диметилсульфоксида, гемина или гексаметиленбисаце-тамида) дифференцируются в клетки, содержащие гемоглобин.
Предыдущая << 1 .. 67 68 69 70 71 72 < 73 > 74 75 76 77 78 79 .. 221 >> Следующая
Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed