Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
5.2.1. Клетки яичников китайских хомячков (линия СНО)
Эта линия клеток и ее многочисленные производные часто используются для синтеза рекомбинантных белков после предварительной эндогенной амплификации соответствующих рекомбинантных генов, введенных в клетки с помощью трансфекции. Спонтанная амплификация генов в нормальных клетках животных является редким событием, а в трансформированных (опухолевых) клетках она происходит с частотой КН-10-6 за клеточную генерацию. Частота амплификации определенных генов может быть повышена в результате некоторых экзогенных воздействий, включая инкубацию клеток с гидроксимоче-виной, афидиколином, канцерогенами, а также под действием ультрафиолетового или у-излучения и в условиях гипоксии. Амплификация гена обычно начинается с его вырезания из хромосомы в составе протяженного сегмента ДНК, сопровождаемого образованием кольцевой структуры, которая продолжает существовать в виде внехромосомного элемента (двойной минихромосомы (double-minutes - DM)), способного к автономной репликации. Предполагают, что DM является промежуточным продуктом амплификации, образующимся в условиях низкого давления селектирующего фактора окружающей среды. На более поздних стадиях амплифицирующаяся ДНК после повторной интеграции в геном обнаруживается преимущественно в составе удлиненного участка хромосомы (extended chromosomal region - ECR), иначе называемого гомогенно окрашивающейся областью (homogeneously staining region - HSR). На этой стадии амплифицированный участок генома клеток, а следовательно, и их фенотип становятся более стабильными.
Для биотехнологических целей в системе амплификации рекомбинантных генов в качестве селектируемого маркера часто используют ген дигидрофолатредуктазы (ДГФР), интегрированный в экспрессирующий вектор. ДГФР катализирует превращение фолиевой кислоты в тетрагидрофолат, необходимый для синтеза эукариотическими клетками глицина, тимидинмонофосфата и пуриновых оснований. В этой связи клетки СНО, в которых ген ДГФР инактивирован под действием мутации, не растут на средах без нуклеозидов и приобретают эту способность после трансфекции геном ДГФР. Растущие трансфектанты далее отбираются по признаку амплификации гена ДГФР на фоне увеличивающихся концентраций метотрексата - ингибитора ДГФР в питательной среде, так как увеличение числа копий гена будет придавать клеткам устойчивость к ингибитору в больших концентрациях. После прове-
л_______
—[IKBS^-CH
IgL huLIF
]i—czz>-«b—
lgH
pA
neo
amp
в
1
huLIF
pA amp
Puc. 17. Кассеты генов в экспрессирующих векторах, использованные для получения фактора, ингибирующего лейкозы, в культурах клеток [257а] а - кДНК huLIF (черные стрелки), включающая лидерные последовательности (незаштрихованные прямоугольники), была интегрирована в экспрессирующий вектор рХМТЗ под контроль гибридного промотора, расположенного между точкой начала репликации вируса SV40 и основным поздним промотором аденовируса (SV40/AdMLP), ДГФР, amp, neo - гены дигидрофолатредукта-зы и устойчивости к ампициллину и неомицину соответственно, VA - трансляционный энхансер; рА - сайт полиаденилирования;
б - вектор pSV2neo-Ig-huLIF, сконструированный на основе транскрипционных и трансляционных регуляторных элементов генов тяжелой (IgH) и легкой (IgL) цепей иммуноглобулинов. Транскрипция кассеты контролируется мышиным промотором гена IgL к и энхансером гена IgH. Транскрипт, содержащий последовательность huLIF, в результате сплайсинга объединяется с экзоном 2 гена IgL, кодирующего лидерную последовательность, которая обеспечивает секрецию зрелого huLIF клетками;
в - вектор pGES-LIF; прямоугольники 1-4 - регуляторная область кластера глобиновых генов, короткая черная стрелка - промотор (3-глобинового гена, ломаной линией отмечены последовательности, удаляемые сплайсингом. Во всех случаях стрелки указывают направление транскрипции
дения множественных раундов селекции получают популяцию клеток, содержащих до нескольких сотен копий гена ДГФР.
Размер амплифицированного геномного локуса значительно больше размера селектируемого гена и может составлять несколько сотен тысяч пар оснований. Трансфекция клеток геном ДГФР и исследуемым рекомбинантным геном, заключенными в один экспрессирующий вектор, сопровождаемая их интеграцией в
геном, будет приводить к их совместной амплификации на фоне метотрексата и усилению синтеза требуемого рекомбинантного белка, как следствие увеличения дозы его гена. Данные о возможности сохранения высокого уровня экспрессии гена в отсутствие селектирующего агента, т.е. генетической стабильности продуцентов, противоречивы. Результат зависит от генотипа конкретных клонов клеток, в том числе и локализации сайта интеграции экспрессирующего вектора в геном клеток СНО. Эффективным экспрессирующим вектором, используемым в описываемой системе, является двухцистронная молекула ДНК, в которой исследуемый рекомбинантный ген находится под контролем сильного промотора перед геном ДГФР, что обеспечивает высокое сопряжение синтеза рекомбинантного белка с уровнем устойчивости клеток к метотрексату (рис. 11, а).
