Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Типы дрожжевых векторов и их характерные особенности. При создании систем экспрессии рекомбинантных генов на основе дрожжей в настоящее время используются четыре типа векторов, которые различаются по способу, которым они обеспечивают существование чужеродной ДНК в дрожжевых клетках [250, 251]. Векторы первого типа, к которым относятся, в частности, векторы на основе дрожжевой интегрирующейся плазмиды Yip (yeast integrating plasmid), используются для встраивания рекомбинантной ДНК в хромосомы дрожжей. У этих векторов отсутствует область начала репликации и они не способны самовоспроиз-водиться в трансформированных клетках. Поэтому единственным способом сохранения их последовательностей в клетках дрожжей является совместная репликация в составе хромосом. Второй тип векторов принадлежит к семейству дрожжевых реплицирующихся плазмид YRp (yeast replicating plasmid). Эти плазмиды способны к автономной репликации в клетках дрожжей благодаря наличию у них ARS-последовательностей (autonomously replicating sequences), о которых уже упоминалось в связи с искусственными хромосомами дрожжей (YAC). ARS-последовательности, по-видимому, представляют собой области начала репликации на хромосомах дрожжей. Векторы третьего шипа образуют так называемое семейство дрожжевых центромерных плазмид YCp (yeast centromere plasmid), которые, как и
следует из их обозначения, содержат в своем составе цетромер-ные последовательности хромосом дрожжей и обладают способностью не только к автономной репликации, но и более стабильному существованию в клетках дрожжей в виде внехромосомных элементов по сравнению с векторами предыдущего семейства. Наконец, векторы семейства дрожжевых эписомных плазмид YEp (yeast episomal plasmid) получены из природной многокопий-ной кольцевой плазмиды дрожжей (2 fim), и объединяют в себе большинство положительных качеств вышеупомянутых векторов. Они существуют в клетках дрожжей во внехромосомном состоянии в большом числе копий, автономно реплицируются и стабильно сегрегируют между делящимися клетками [252].
Все перечисленные векторы являются челночными, т.е. допускают проведение этапов субклонирования фрагментов ДНК и наработки их в большом количестве с использованием клеток Е. coli. Это становится возможным благодаря наличию у них области начала репликации плазмиды pBR322, а также селектируемых маркеров в виде генов Ыа и tet, придающих бактериальным клеткам устойчивость к ампициллину и тетрациклину, соответственно. Селективный характер роста клеток дрожжей при наличии у них векторных молекул также обеспечивают селектируемые маркеры векторных плазмид. К ним относятся гены, дающие возможность деления ауксотрофных штаммов дрожжей на средах без соответствующих пищевых добавок: URA3, LEY2, HIS3, TRP1 или LYS2, которые восстанавливают способность ауксотрофов синтезировать, соответственно, урацил, а также аминокислоты Leu, His, Тгр или Lys. Использование гена JJRA3 в качестве контр-селективного маркера рассмотрено в разделе о дрожжевых дигибридных системах оценки белок-белковых взаимодействий во второй части книги.
Эффективную транскрипцию рекомбинантных генов в клетках дрожжей обеспечивают специфические регуляторные элементы, промоторы и терминаторы транскрипции. Высокий уровень синтеза РНК на клонированных последовательностях в клетках S. cerevisiae может иметь место при использовании промоторных участков генов гликолиза: GAL4, ADH, PGK или GAPDH. При этом для исключения отрицательного влияния рекомбинантных белков на дрожжевые клетки промоторы должны быть индуцируемыми. Фрагменты ДНК, выполняющие роль терминаторов транскрипции часто берут начало от 3’-концевых последовательностей генов PGK, РН05 или TRP1. При этом последовательности 3’-концевых нетранслируемых участков генов могут оказывать большое влияние на эффективность транскрипции и трансляции клонированных рекомбинантных последовательностей.
Соблюдение условий, необходимых для транскрипции и трансляции клонированных генов, как и в случае бактериальных систем экспрессии, еще не гарантирует высокий уровень синтеза кодируемого этим геном белкового продукта. Многие белки (и мРНК) нестабильны в клетках дрожжей. Так, проинсулин человека крайне нестабилен в дрожжевых системах экспрессии (это не относится к рекомбинантному интерферону а2). На эффективность экспрессии рекомбинантных генов в клетках дрожжей оказывает влияние множество до конца не изученных факторов, и оптимизация этого процесса при решении конкретных биотехнологических задач в каждом случае требует проведения специальных исследований.
Введение векторной ДНК в клетки дрожжей может быть осуществлено несколькими способами: в сферопласты в присутствии ионов Са2+ и полиэтиленгликоля, которые, в свою очередь, получают разрушением клеточной стенки с помощью ферментов. Кроме того, используются методы, основанные на применении ацетата лития или электропорации [253, 254].
Использование дрожжевых систем экспрессии в биотехнологии и научных исследованиях. Крупномасштабный синтез рекомбинантных белков является одной из основных целей, для достижения которой конструируются системы экспрессии рекомбинантных генов в клетках дрожжей [255]. Синтезируемые рекомбинантные белки могут накапливаться в цитоплазме клеток, после чего их выделяют по традиционной схеме с использованием многостадийной очистки из бесклеточных экстрактов, получаемых после разрушения клеток. Популярными также являются системы, обеспечивающие секрецию рекомбинантных белков в культуральную среду. В этом случае секрецию можно обеспечить, например, включением в рекомбинантный белок аминокислотной лидерной последовательности препро-а-фактора S. cerevisiae, которая направляет синтезируемые молекулы в секреторные гранулы [256].
