Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
5.4. Бесклеточные белоксинтезирующие системы
Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают бесклеточные системы [260]. Любая бесклеточная система создается, прежде всего, для моделирования конкретных биохимических процессов, происходящих в живом организме, и во время функционирования воспроизводит некоторые существенные особенности жизнедеятельности клетки. В генной инженерии бесклеточные белоксинтезирующие системы часто используются для исследования кодирующего потенциала и механизмов экспрессии клонированных генов in vitro, а также на промежуточных этапах конструирования рекомбинантных генов для идентификации мРНК или фрагментов ДНК по кодируемым белкам.
Большим преимуществом бесклеточных систем перед целыми клетками является доступность их отдельных компонентов для экспериментальных воздействий. Такие системы позволяют исследовать влияние различных экзогенных факторов на их функционирование (ионные условия, pH, ингибиторы и активаторы и т.п.). Кроме того, в бесклеточной системе можно легко заменять отдельные компоненты или непосредственно воздействовать на них в изолированном состоянии и затем по реакции системы познавать их функциональную значимость. Большинство результатов, полученных с помощью бесклеточных систем, невозможно было бы иметь при использовании живых клеток, так как последние при нарушении гомеостаза нередко гибнут. При этом бывает трудно определить, какой же компонент оказался критическим. К сожалению, перечисленные достоинства бесклеточных систем одновременно являются их слабым местом, поскольку после разрушения клеток безвозвратно исчезают те многочисленные взаимодействия между их компонентами, благодаря которым можно без труда отличить живую клетку от бесклеточного экстракта.
Бесклеточные белоксинтезирующие системы представляют собой одни из самых сложных и многокомпонентных систем in vitro, используемых в биохимии. Это связано с необходимостью воспроизведения в пробирке всех этапов биосинтеза белка, включая транскрипцию, аминоацилирование тРНК и трансляцию мРНК рибосомами. Тем не менее, уже более 30 лет удается успешно осуществлять процесс биосинтеза белка in vitro и использовать такие системы по трем основным направлениям: для анализа кодирующего потенциала нуклеиновых кислот, исследования механизмов биосинтеза белка и препаративной наработки некоторых рекомбинантных белков и пептидов.
По природе компонентов, которые определяют способность
бесклеточных систем осуществлять трансляцию определенных мРНК, принято различать прокариотические и эукариотические системы. Естественно, что наиболее эффективная трансляция мРНК происходит в гомологичных бесклеточных системах. Однако под контролем гомологичных регуляторных элементов в бесклеточных системах могут быть успешно транслированы и чужеродные мРНК - транскрипты рекомбинантных генов.
В некоторых бесклеточных системах транслируют предварительно очищенную мРНК или используют эндогенную мРНК, присутствующую в полисомах. В других белоксинтезирующих системах - системах сопряженной транскрипции и трансляции, одновременно происходят синтез мРНК и ее трансляция рибосомами.
Из-за высокой стоимости очищенных компонентов в подавляющем большинстве случаев бесклеточные системы биосинтеза белка используют в аналитическом варианте, когда объем пробы не превышает 100 мкл. Однако в последнее время разработаны проточные белоксинтезирующие системы, в которых процесс трансляции удается поддерживать длительное время, непрерывно подводя извне расходуемые вещества, с одновременным удалением синтезируемых белков и продуктов деградации компонентов системы. Основные принципы получения и функционирования всех разновидностей белоксинтезирующих систем будут рассмотрены ниже.
5.4.1. Прокариотические системы
Среди прокариотических бесклеточных белоксинтезирующих систем наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток Е. coli, хотя основные принципы, используемые для их получения, могут быть применены и для других бактериальных клеток. Прокариотическая, как и любая другая бесклеточная система биосинтеза белка, должна содержать несколько обязательных компонентов: 1) рибосомы и белковые факторы трансляции; 2) матричный полирибонуклеотид (мРНК или синтетические полинуклеотиды); 3) аминоацилированные тРНК; 4) GTP в качестве источника энергии; 5) одновалентные
(К+ или NH4 ) и двухвалентные (Mg2+ или Са2+) катионы, а также
буферные вещества для поддержания pH системы в физиологических пределах.
Одним из наиболее важных условий функционирования бесклеточных систем биосинтеза белка является нативное состояние рибосом и факторов трансляции. В качестве источников этих компонентов в бактериальных бесклеточных системах чаще все-
го используют экстракты соответствующих клеток. Бактериальные клетки выращивают на богатой питательной среде, суспендируют в буфере и разрушают тем или иным способом. Лизат центрифугируют при 30 ООО g. При этом в супернатанте (так называемом БЗО-экстракте) остаются рибосомы и остальные белковые факторы трансляции, необходимые для функционирования системы. Кроме того, в нем содержатся бактериальные ДНК и мРНК, которые, если от них не освободиться, приводят к неспецифическому синтезу белка в бесклеточной системе.
