Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Метилотрофные дрожжи Pichia pastoris. С 1984 г., когда ме-тилотрофные дрожжи впервые начали использовать в биотехнологии, с помощью этих микроорганизмов было получено более 300 рекомбинантных белков. Популярность этого вида дрожжей связана прежде всего с тем, что в их системах экспрессии можно использовать один из самых сильных регулируемых промоторов гена алкогольоксидазы (.ЛОХ/), что обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантных генов. Промотор репрессируется глюкозой или другими источниками углерода и активируется в 1000 раз после переноса клеток на среду с метанолом в качестве единственного источника углерода. Кроме того, имеются конститутивный промотор гена GAP, а также промотор гена
FLD1, кодирующего глютатион-зависимую формальдегиддегид-рогеназу, который индуцируется метанолом и метиламином (нетоксичным источником азота). Кроме того, векторные плазмиды этого микроорганизма допускают стабильную интеграцию рекомбинантных генов в строго определенные участки дрожжевого генома в виде одной или нескольких копий. При этом сами клетки могут культивироваться в ферментерах с высоким выходом. Немаловажным обстоятельством является и доступность дрожжевых штаммов в виде наборов для клонирования, которые продаются фирмой Invitrogen (США).
На основе Saccharomyces cerevisiae созданы высокоэффективные системы экспрессии рекомбинантных генов и крупнотоннажного синтеза рекомбинантных белков человека, животных и растений, в том числе и рекомбинантных антител (см. раздел II.3.4) [257]. Кроме того, экспрессия рекомбинантных белков в этих клетках активно используется для улучшения свойств белков методами направленной эволюции с использованием клеточного дисплея (раздел II.2.3.2), изучения белок-белковых взаимодействий в дрожжевых л-гибридных системах (раздел II.2.3.4) и для множества других не менее важных целей.
5.2. Системы экспрессии, основанные на культуре клеток животных
Только на первый взгляд экспрессия рекомбинантных генов в бактериальных и дрожжевых клетках под контролем хорошо изученных регуляторных элементов представляется простой задачей. На практике, как уже обсуждалось ранее, экспрессия эукариотических генов в бактериях происходит неэффективно из-за образования нерастворимых телец включения и отсутствия необходимых посттрансляционных модификаций рекомбинантных полипептидных цепей. Для преодоления этих и некоторых других затруднений в последнее время широко используются культивируемые клетки животных и растений.
Эффективный синтез рекомбинантных белков зависит не только от используемых клеточных линий. Основное влияние на этот процесс оказывают конструкция экспрессирующего вектора, а также метод введения рекомбинантных ДНК в эукариотические клетки. В последнем случае низкая эффективность доставки рекомбинантных молекул в клетки и неоптимальная локализация сайтов их интеграции в геном могут свести на нет все достоинства клеточных линий и экспрессирующих векторов. Для повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов, стабиль-
но интегрированных в геном культивируемых клеток, разработаны методы их селективной амплификации. С использованием одного из них получены мутантные сублинии клеток яичников китайских хомячков СНО, в которых амплификация происходит в присутствии селектирующего агента, например, метотрексата. Другие системы амплификации основаны на подавлении экспрессии жизненно важных ферментов, например, глутаминсинтетазы или аденозиндезаминазы, под действием специфических ингибиторов: метионинсульфоксимина или 2’-дезоксикоформицина, соответственно. Клеточные линии и клоны, стабильно продуцирующие рекомбинантные белки, как правило, получают путем отбора из пула гетерогенных клеток. И, наконец, еще одним существенным условием успешной экспрессии рекомбинантных генов является оптимизация самого процесса культивирования клеток, включая тщательный подбор культуральных сред.
Для получения небольшого количества рекомбинантных белков и контроля функциональной целостности генно-инженерных конструкций кроме вышеупомянутого подхода часто применяют временно экспрессирующиеся векторы, которые обладают способностью к репликации в культивируемых клетках COS во внехромо-сомном состоянии. В этом случае источником рекомбинантных белков являются супернатанты клеток. При другом подходе рекомбинантные белки синтезируют в культивируемых клетках насекомых после их заражения векторами на основе генома бакуловиру-сов. Последний подход становится все более популярным, так как допускает стабильную экспрессию многих рекомбинантных генов, продукты которых могут находиться как внутри клеток, так и в ассоциированном с поверхностью клеток состоянии, или они могут секретироваться в культуральную жидкость.
Недавно швейцарскими исследователями было проведено сравнительное изучение эффективности экспрессии гена цитоки-на человека - фактора, игнибирующего леккозы (leukemia inhibitory factor - huLIF) в разных эукариотических системах [257а]. Фактор huLIF представляет собой белок среднего размера, полипептидная цепь которого содержит несколько потенциальных сайтов N-гликозилирования и в процессе фолдинга образует три дисульфидные связи. Поскольку полученные результаты представляют большой практический интерес для генной инженерии и биотехнологии, так как иллюстрируют многие основные принципы функционирования рекомбинантных генов в гете-рологичных системах экспрессии, они будут кратко рассмотрены ниже.
