Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
С помощью ПЦР можно амплифицировать in vitro сегменты ДНК длиной от 0,1 до 5-7 т.п.о. и более, а для получения положительного результата достаточно присутствия в реакционной смеси одной-двух копий амплифицируемой последовательности нуклеотидов (например, геномной ДНК, содержащейся в одной-двух соматических клетках). При этом теоретически нет необходимости в тщательной очистке матрицы, так как большинство находящихся в реакционной смеси белков и ферментов инактивируется в первых же циклах ПЦР и не оказывает влияния на протекание реакции при высоких температурах.
6.1.2. Критические компоненты реакции
При практическом использовании ПЦР, по крайней мере, три характеристики этого метода наиболее важны для исследователя - это специфичность реакции, точность синтеза ДНК и его эффективность [263]. При абсолютной специфичности ПЦР продукт должен быть копией именно того локуса, который амп-лифицировали, а другие амплифицированные последовательности нуклеотидов в продукте ПЦР не должны присутствовать. При этом, как правило, не обращают внимания на то, имеются ли в продукте ПЦР ошибочно включенные нуклеотиды, которые некомплементарны амплифицируемому участку ДНК и появляющиеся благодаря сбоям в работе ДНК-полимеразы. Такой подход имеет место, например, при ДНК-диагностике инфекционных за-
болеваний, когда определяют наличие в исследуемом образце нуклеиновых кислот возбудителя. В этом случае вполне достаточно, чтобы специфический продукт ПЦР был представлен эле-ктрофоретически гомогенным набором молекул, соответствующих амплифицируемому участку матрицы.
Требования к точности амплификации резко повышаются в том случае, если последовательность нуклеотидов продукта ПЦР критична для проводимого исследования. Ошибки в амплификации недопустимы при определении первичной структуры ампли-фицируемого локуса, или при использовании продукта ПЦР для синтеза кодируемого им белка в генно-инженерных системах экспрессии.
Эффективность ПЦР количественно оценивается по выходу продукта ПЦР после завершения реакции. Хотя теоретически количество продукта в реакционной смеси после каждого цикла ПЦР удваивается, на практике этого никогда не происходит. Как и в любой другой химической реакции выход продукта ПЦР можно увеличить путем оптимизации критических параметров реакции. Однако действие многих компонентов в ПЦР взаимозависимо, поэтому изменение свойств одного из компонентов, как правило, влечет за собой необходимость в оптимизации свойств и других.
Одними из наиболее критических компонентов для специфичности ПЦР и ее эффективности являются олигонуклеотид-ные праймеры, поэтому наш краткий обзор компонентов реакции, которые оказывают существенное влияние на ее протекание, мы начнем именно с дизайна праймеров.
6.1.3. Конструирование праймеров
Определившись с локусом в ДНК, который в зависимости от цели исследования необходимо амплифицировать, переходят к разработке праймеров. В большинстве случаев длина праймеров должна быть в пределах 18-30 нт, однако при проведении направленного мутагенеза могут быть использованы праймеры большей длины, в том числе и мегапраймеры (см. раздел 1.2.4, части II).
GC-Состав праймеров, который определяет температуру плавления (Тт) гибрида, образованного праймерами и матрицей, должен находиться в пределах 35-65% (в идеале 45-55%) и по возможности быть одинаковым у обоих праймеров. Конечно, состав праймеров полностью определяется первичной структурой амплифицируемого участка матрицы. Но в том случае, если состав оказывается сильно смещенным в сторону АТ или GC,
допускается добавление на 5’-концы праймеров нескольких остатков G и/или С, и, соответственно, А и/или Т, некомплементарных матрице. Имеется еще один прием, который позволяет повышать Тт гибридов без изменения первичной структуры праймеров, что бывает необходимо для амплификации участков ДНК с высоким GC-составом и при наличии в них самокомпле-ментарных повторяющихся последовательностей. В этом случае при синтезе праймеров применяют аналоги нуклеотидов, которые образуют более прочные связи со своими комплементарными партнерами [263].
Во время амплификации обычно используют температуру отжига (Та) праймеров на 5 °С ниже их расчетной ('Тт), которую обычно определяют с помощью олигонуклеотидных калькуляторов (см., например, http://www.nwfsc.noaa.gov/protocols/ oligoTMcalc.html). Различия между Тт у пары праймеров в 4-6 °С обычно не сильно оказывают влияние на эффективность ПЦР, однако лучше если их Тт совпадают. Если различия между праймерами слишком велики, то можно изменить их GC-состав, удлинив один из праймеров в соответствии с амплифицируемой последовательностью с 3 - или 5-конца (в первом случае не происходит изменения размера образующегося продукта ПЦР). Для приблизительного расчета Та вручную можно воспользоваться формулами [263]:
[4(G + С) + 2(А + Т)] - 5°С при длине праймера < = 20 нт, или
62,3°С + 0,41 °С (%G-C) - 500/длина праймера - 5°С, при длине праймера >20 нт.
Кроме вышеупомянутых особенностей дизайна праймеров, при их конструировании полезно иметь в виду следующее:
