Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 84

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 78 79 80 81 82 83 < 84 > 85 86 87 88 89 90 .. 221 >> Следующая

Весь мой опыт биохимической работы показывает, что каким бы авторитетным источником данных ты ни пользовался при налаживании искусственной генетической системы, для того, чтобы она хорошо работала, конкретные условия необходимо подбирать самому. Это особенно относится к сложным многокомпонентным системам. Этап оптимизации системы в экспериментальной работе является очень полезным не только из-за чисто утилитарных соображений. В ходе предварительных опытов убеждаешься, что у тебя наладился диалог с системой и она отвечает на твои вопросы. Любая система на адекватно (разумно) поставленный вопрос дает исчерпывающий ответ, но нашего интеллекта, как правило, не хватает, чтобы сразу интерпретировать полученный результат правильно. Только в ходе налаженного диалога с системой можно постепенно приблизиться к истине.
6.2.1. Появление неспецифических продуктов ПЦР
Одним из самых неприятных артефактов, с которым приходится сталкиваться при постановке ПЦР, это появление продукта ПЦР в обязательном отрицательном контрольном образце, т.е. в отсутствие матрицы. Такие артефакты относятся к категории ложноположительных результатов. Причиной, чаще всего, является загрязнение компонентов реакции или лабораторного пластика продуктами ПЦР, что может легко произойти в процессе постановки массовых ПЦР, например, в ДНК-диагностике при недостаточно чистой работе. При появлении этого грозного признака неаккуратной работы приходится менять загрязненный
компонент, на практике же, в целях экономии времени, - все компоненты реакционной смеси. Поэтому, по возможности, необходимо работать с небольшими аликвотами компонентов, а их основные запасы хранить отдельно, подальше от аппаратов для электрофореза и открывать в редких случаях. Кроме того, готовить образцы для ПЦР и проводить электрофоретический анализ продуктов ПЦР следует в разных помещениях.
Из предлагаемых способов борьбы с кроссконтаминацией образцов продуктами ПЦР предыдущих опытов можно отметить облучение лабораторного пластика ультрафиолетовым светом [264] или инкубацию с гипохлоритом натрия [265], а также использование фотохимических и ферментативных методов [266-269].
Дополнительные неспецифические продукты могут образовываться и при безукоризненном отрицательном контроле. В этом случае причиной их появления могут быть слишком высокая концентрация праймеров или их чересчур большая вырожденность. В ряде случаев приходится менять праймеры, так как условия использования некоторых из них нельзя оптимизировать. Весьма часто избавиться от неспецифических продуктов в виде “шмира” или дискретных полос можно с помощью “горячего старта” и/или “гнездовой” ПЦР, но у последнего подхода есть свои недостатки (см. ниже). Плохая денатурация матрицы также может приводить к появлению неспецифических продуктов. К тому же результату может приводить и высокая концентрация ионов Mg2+, dNTPs или ДНК-полимеразы. В случае с ионами Mg2+, их концентрацию оптимизируют путем постепенного уменьшения с интервалом 0,2-0,5 мМ. Присутствие ингибиторов ПЦР в пробе часто отрицательно сказывается на специфичности реакции.
Слишком низкая температура отжига праймеров приводит к их взаимодействию с матрицей в неспецифических местах и также может быть причиной образования неспецифических продуктов ПЦР в конкретном случае, что может быть и следствием чрезмерной продолжительности циклов, излишнего числа циклов для данного количества копий матрицы в пробе или медленной скорости перехода между отдельными сегментами циклов. Скорость перехода от сегмента к сегменту в цикле ПЦР называют рэмпом. В современных амплификаторах этот параметр можно изменять, и он также требует оптимизации в сложных случаях.
Димеры праймеров. При наличии основного продукта ПЦР образование димеров праймеров, которые иногда появляются в виде полосы, идущей при электрофорезе впереди бромфеноло-вого синего, как правило, можно игнорировать, хотя это и не радует глаз. Однако, если данный процесс становится интенсив-
ным, то происходит конкуренция за субстраты ПЦР со стороны димеров. В редких случаях образуются исключительно димеры и тогда приходится с ними бороться. Причинами образования димеров могут быть: комплементарность праймеров в их У-концевых частях, слишком короткие праймеры, их чрезмерно высокая концентрация или же низкая концентрация матрицы. Димеры праймеров могут образовываться и при наличии у них гомологии с повторяющимися последовательностями матричной ДНК, а также при “переамплификации” с избыточным числом циклов и использовании субоптимальных температур отжига праймеров,
Появление продуктов ПЦР, не соответствующих по размерам ожидаемым. Такой результат ПЦР чаще всего указывает на артефакт, но иногда может быть и открытием нового полиморфизма в матричной ДНК, возникшего в результате делеции или вставки. По крайней мере, подобный результат должен настораживать. Система амплификации на основе ПЦР, как и любая другая искусственная генетическая система, является “вещью в себе”, законы существования которой не вполне понятны. Это особенно относится к тем сложным случаям амплификации, когда в качестве матрицы используется ДНК целого большого генома, например, генома человека. В данном случае единственным доказательством того, что амплифицирован нужный локус, будет подтверждение происхождения продукта на уровне его первичной структуры. Быстрее всего убедиться в адекватности продукта можно путем исследования сайтов рестрикции. Однако, даже наличие предсказанных сайтов из-за сложности исследуемого объекта не дает полной гарантии того, что артефакта удалось избежать. Окончательным доказательством амплификации нужного генетического локуса может служить только полное секвени-рование продукта ПЦР.
Предыдущая << 1 .. 78 79 80 81 82 83 < 84 > 85 86 87 88 89 90 .. 221 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed