Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Такое простое усовершенствование бесклеточной системы сильно изменило характер ее функционирования. Биосинтез белка в ней может продолжаться непрерывно в течение нескольких десятков часов, причем на одну молекулу транслируемой мРНК синтезируются сотни копий полипептидных цепей белков, суммарный выход которых может достигать 200 мкг и более на 1 мл бесклеточного экстракта.
С разработкой проточной бесклеточной белоксинтезирую-щей системы стало возможным проводить биосинтез рекомбинантных белков в препаративных количествах in vitro. Такая система позволяет синтезировать в больших количествах полипептиды, подверженные быстрой внутриклеточной деградации про-теиназами или образующие тельца включения в живых клетках. Проточная система может быть полезна также для получения белков, обладающих цитотоксической активностью, или других рекомбинантных полипептидов, для которых нежелательны ар-тефактные посттрансляционные модификации, происходящие in vivo. Недавно в таких системах удалось получить препаративные Количества функционально активного интерлейкина 6 человека.
Гпава 6
Полимеразная цепная реакция и другие способы амплификации ДНК и сигналов
В 1985 г. К.Б. Мюллис и др. опубликовали и запатентовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), которому суждено было оказать глубочайшее влияние на все области исследования и прикладного использования нуклеиновых кислот [261,262]. Значение этого метода для молекулярной биологии и генетики оказалось столь велико и очевидно, что уже через семь лет автору была присуждена Нобелевская премия по химии. Возможность амплификации любого сегмента ДНК, последовательность нуклеотидов которого известна, и получение его по завершении ПЦР в гомогенном виде и препаративном количестве делают ПЦР альтернативным методом молекулярного клонирования коротких фрагментов ДНК. При этом не возникает необходимости в применении сложных методических приемов, которые используют в генной инженерии при обычном клонировании. Разработка метода ПЦР во многом расширила методические возможности молекулярной генетики, и, в частности, генной инженерии, причем настолько, что это кардинально изменило и усилило научный потенциал многих ее направлений. Реалии исследовательской жизни указывают на то, что этому методу нужно уделить в нашем рассказе более пристальное внимание.
6.1. Проведение ПЦР
6.1.1. Общая схема ПЦР
Принцип ПЦР заключается в следующем (рис. 18). Реакционная смесь обычно содержит матричную ДНК, четыре дезоксири-бонуклеозидтрифосфата dATP, dCTP, dGTP и ТТР, Taq-полиме-разу и два синтетических олигодезоксирибонуклеотидных праймера длиной 15-30 нуклеотидов, комплементарных участкам противоположных цепей ДНК, фланкирующих исследуемый участок ДНК-матрицы. ПЦР начинается с кратковременного (1-2 мин) прогревания реакционной смеси при ~95°С. При этом происходит плавление цепей ДНК и инактивация примесных белков, которые могут присутствовать в реакционной смеси, если используется недостаточно очищенная ДНК, например, из кли-
Циклы
Олигонуклеотидные
праймеры
5'
>Цепи ДНК
5'
¦3'
5'
3'
5'
5'
3'
Продукты
ПЦР
23 продуктов ПЦР
• • •
п |
2й'1 продуктов ПЦР
Рис. 18. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
нических образцов. Далее реакционную смесь охлаждают до температуры отжига праймеров с матричной ДНК (37-65°С). В результате праймеры связываются с комплементарными местами на матрице и с этого момента начинают служить затравками для синтеза Taq-полимеразой новых цепей ДНК, комплементарных каждой из цепей денатурированной матричной ДНК. Для проведения синтеза ДНК в оптимальных для Taq-полимеразы условиях температуру реакционной смеси поднимают до 72°С и при такой температуре проводят элонгацию цепей вновь синтезирую-
7. Патрушев Л.И. Т. 1
щейся ДНК в течение 0,5-2 мин. По окончании стадии синтеза ДНК заканчивается первый цикл ПЦР, после чего проводятся такие же второй, третий и последующие циклы в автоматическом режиме. После завершения третьего цикла уже образуется дискретный продукт ПЦР - фрагмент дцДНК, содержащий на своих 5’-концах последовательности нуклеотидов праймеров. Количество продукта ПЦР в реакционной смеси после завершения каждого цикла удваивается и, следовательно, по мере прохождения реакции экспоненциально возрастает, достигая нескольких микрограммов в реакционной смеси объемом 25-50 мкл. В финале ПЦР содержимое реакционной смеси анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого эти-дия, где продукт реакции выявляется в УФ-свете. Продукт ПЦР можно выделить из агарозного геля в чистом виде и работать с ним как с обычным фрагментом дцДНК, т.е. гидролизовать рес-триктазами, клонировать в плазмидных векторах по липким и тупым концам, секвенировать или использовать в качестве зондов при гибридизации.
