Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Позиционное клонирование. Метод позиционного клонирования часто используется для выделения неизвестных генов с неизвестным положением на генетической карте, присутствие которых можно определить только на основании характерного фенотипа организма, например, симптомов заболевания [239-241]. Для клонирования таких генов в больших выборках определяют связь между передачей определенного молекулярного маркера потомству и исследуемого фенотипа. В качестве таких молекулярных маркеров часто используют характерный полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ-маркеры - маркеры полиморфизма по длинам рестрикционных фрагментов ДНК - RFLP - restriction fragment length polymorphism) или длину полиморфных микросателлитных локусов. Анализ проводится в большом количестве семей, у которых наблюдается передача исследуемого фенотипа от родителей потомству. Если в ходе проведения таких исследований достоверно устанавливается, что фе-
нотип с высокой частотой передается потомству вместе с конкретным молекулярным маркером, то делается вывод о расположении маркера и искомого гена, определяющего исследуемый фенотипический признак, на одной хромосоме недалеко друг от друга. Это дает возможность провести отбор клонов в клонотеке последовательностей, составленной из крупных фрагментов ДНК, с помощью зонда на выявленный полиморфный маркер. В составе обнаруженного таким образом фрагмента с определенной вероятностью может оказаться и ген, определяющий появление исследуемого фенотипического признака (симптомов заболевания). Поскольку данный метод отбора основан исключительно на определении положения искомого гена относительно полиморфного маркера (в том числе и другого гена), он получил название позиционного клонирования.
4.2.2. Повторный скрининг
Часто при первичном отборе клоны на чашках Петри вырастают настолько плотно, что после гибридизации с зондом бывает трудно выделить с первого раза бактерии, относящиеся к одному клону или фаговые частицы одной бляшки, которые дали положительный сигнал во время проведения первого раунда отбора. В этом случае бактериальные клетки или фаговые частицы, выделенные из зоны сигнала, рассевают до отдельных колоний или бляшек и используют во втором раунде отбора. Как правило, с помощью такого простого подхода удается “расчистить” нужные клоны и выделить их в гомогенном состоянии.
4.2.3. Субклонирование
При субклонировании вставку рекомбинантной ДНК, выделенную из вектора изолированного клона, переносят в новый вектор, который дает возможность ее исследования в более простых условиях и с затратой меньших усилий. Если вставка была получена в фаговом, космидном векторе или с использованием искусственной хромосомы, что предполагает ее большой исходный размер, то она может быть переклонирована по частям в плазмидном векторе, и это может значительно облегчить ее дальнейшее исследование, например, с помощью секвенирова-ния.
Гпава 5
Системы экспрессии рекомбинантных генов
Выделение любого нового рекомбинантного гена, как правило, заканчивается попытками получения его полноценной экспрессии в искусственных генетических системах, т.е. наработки в препаративном количестве полноценного в функциональном отношении рекомбинантного белка. В настоящее время имеется множество систем экспрессии рекомбинантных генов, среди которых наибольшее применение в биотехнологии находят модифицированные различным образом микроорганизмы. Поскольку такие системы не позволяют решить многих проблем, связанных с экспрессией эукариотических рекомбинантных генов, в том числе, осуществления посттрансляционных модификаций рекомбинантных белков, в ряде случаев для решения этих проблем используют культивируемые клетки животных и растений. Для изучения механизмов экспрессии генов в лабораторных условиях большую пользу приносят так называемые пермеабилизованные культивируемые клетки с полупроницаемыми мембранами, что можно сделать в определенных условиях. Кроме того, незаменимыми помощниками молекулярных биологов и генетиков остаются бесклеточные белоксинтези-рующие системы, один из вариантов которых, а именно проточные системы, находит применение и в промышленном производстве пептидов. Принципы, лежащие в основе использования таких систем, будут кратко рассмотрены ниже.
5.1. Экспрессирующие системы микроорганизмов
Приемы конструирования векторов, экспрессирующих рекомбинантные гены в бактериальных клетках, а также основные проблемы, возникающие при попытках экспрессии чужеродных генов в бактериях, были уже кратко рассмотрены в разделе 3.6. Здесь же мы проиллюстрируем этот материал некоторыми современными достижениями в разработке бактериальных систем экспрессии.
5.1.1. Грамотрицательные бактерии
Escherichia coli. Кишечная палочка Е. coli, несомненно, является одним из наиболее изученных биологических объектов, используемых в биотехнологии для получения рекомбинантных белков. В том случае, если для конкретного белка удается подо-
Таблица 7
Примеры использования клеток Е. coli для промышленного производства рекомбинантных белков
