Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Область применения Примеры использования Преимущества систем
рекомбинантных белков экспрессии и очистки
Антигены Получение поликлональных ан Возможность масш
тител [242] табирования, отсутст
вие эндотоксинов
Антитела и их Получение рекомбинантных Возможность
фрагменты одноцепочечных антител и их масштабирования
фрагментов (см. II.3.4.2)
Ферменты, в том Получение катехолдиоксигеназ Правильный фол-
числе, с улучшен для устранения хлорсодержа динг, возможность
ными свойствами щих загрязнений окружающей масштабирования
среды [243], разнообразные
ферменты для научных иссле
дований
Структурные ис Получение меченых белков для Правильный фолдинг
следования белков ЯМР-спектроскопии [244]
Лекарственные Производство рекомбинантного Высокая степень
средства инсулина, интерферона и т.д. очистки, отсутствие
[245] эндотоксинов
брать адекватную систему вектор-хозяин, то его получение в препаративном количестве, в том числе, и крупномасштабное производство становится недорогим, быстрым и легко масштабируемым процессом. В табл. 7 приведены некоторые примеры использования Е. coli в современной биотехнологии для производства рекомбинантных белков.
Pseudomonas aeruginosa. Как уже упоминалось, экспрессия чужеродных белков в стандартном хозяине, Е. coli, чаще всего сопровождается образованием телец включения, из которых выделение нативного белка может представлять серьезную проблему. Данную проблему позволяют решать системы экспрессии рекомбинантных генов, разработанные на основе гра-мотрицательной бактерии P. aeruginosa, обеспечивающих секрецию синтезирующихся гетерологичных белков в питательную среду [246]. Эта бактерия осуществляет биосинтез и секре-тирует большое количество внеклеточных ферментов, в том числе, и различные гидролазы, которые представляют интерес для биотехнологии. Для фолдинга и секреции таких ферментов у Р. aeruginosa имеются высокоэффективные, специфические
механизмы. У этой бактерии известно, по крайней мере, пять путей секреции, в реализации которых задействовано от трех до двенадцати различных белков [247]. Кроме того, несколько специальных дисульфидоксидоредуктаз и протеиназ участвуют в фолдинге секретируемых белков в периплазматическом пространстве [248, 249]. Все эти особенности P. aeruginosa были использованы для создания высокоэффективных штаммов-проду-центов гетерологичных рекомбинантных белков.
Штамм PABST7.1 P. aeruginosa эффективно используется для сверхэкспрессии рекомбинантных генов, транскрипция которых осуществляется с сильного Т7-промотора, успешно используемого для тех же целей в клетках Е. coli. Ген Т7-РНК-полимеразы, осуществляющей транскрипцию с этого промотора, был клонирован под индуцируемым промотором, который контролируется Ьас-репрессором, кодируемым геном 1ас1% расположенным сразу за геном Т7-РНК-полимеразы. Оба этих гена стабильно интегрировали в хромосому штамма P. aeruginosa PABS1, дефектного по биосинтезу липазы, превратив бактериальные клетки в сверхпродуцента Т7-РНК-полимеразы. Одновременно был получен штамм P. aeruginosa PABST7.7, у которого ген Т7-РНК-полимеразы был интегрирован непосредственно в структурную часть гена липазы lip А. Оба штамма оказались пригодными для сверхэкспрессии мутантных генов липазы. Такой подход позволяет внедрять ген Т7-РНК-полимеразы в любой хромосомный ген P. aeruginosa, что сопровождается его инактивацией на фоне сверхэкспрессии Т7-РНК-полимеразы, и позволяет следить за появлением активности клонируемого гомологичного рекомбинантного гена.
Вторую часть обсуждаемой системы экспрессии составляет плазмида pUCPL6AN, в которой липазный оперон ИрА/Н клонирован под контролем Т7-промотора. Плазмида содержит уникальные сайты рестрикции Nhel и Apal, локализованные в 5 - и 3-концевых частях гена ИрА, что позволяет заменять этот ген на любой клонируемый. При этом не затрагиваются сигнальная последовательность и 3'-концевые регуляторные последовательности исходного гена, которые необходимы для специфического распознавания белка фолдазой, специфичной в отношении липазы. Такая система позволяет осуществлять сверхэкспрессию и скрининг больших клонотек мутантных генов в направленной эволюции белковых молекул непосредственно на основании ферментативной активности секретируемых мутантных белков, а также нарабатывать нативные рекомбинантные белки в препаративном количестве.
5.1.2. Клетки дрожжей как экспрессирующие системы
Наряду с бактериальными системами, клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae или Schizosaccharomyces pombe широко используются для экспрессии рекомбинантных генов и позволяют получать большое количество рекомбинантных белков с высоким выходом. Однако, в отличие от бактериальных клеток, клеточные стенки которых содержат опасные для здоровья токсичные и пиро-генные компоненты, дрожжи лишены такого недостатка. Это делает дрожжевые системы экспрессии предпочтительными при производстве лекарственных и пищевых рекомбинантных продуктов. Кроме того, дрожжи, как эукариоты, обладают развитой системой эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, а, следовательно, способны к осуществлению посттрансляционных модификаций рекомбинантных белков. Как и в случае любых других систем экспрессии рекомбинантных генов, для того чтобы дрожжевая система функционировала, необходимо ввести рекомбинантные гены в клетки в составе стабильного экспрессирующего вектора, и обеспечить эффективную транскрипцию и трансляцию рекомбинантных нуклеотидных последовательностей.
