Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 91

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 221 >> Следующая

(но не т5С) в U. В этом случае праймеры в ПЦР могут быть подобраны таким образом, что их элонгация будет происходить при наличии соответствующих модификаций в анализируемом участке ДНК, однако, еще более информативным окажется секвени-рование продуктов ПЦР, в результате которого легко обнаруживаются замены С —> U (рис. 21, б). Данный метод обладает высокой чувствительностью (требуется не более 10 нг ДНК) и позволяет количественно оценивать наличие т5С в исследуемых образцах, обнаруживая до 5% метилированных остатков С в анализируемом ампликоне.
6.3.11. Иммуно-ПЦР
Иммуно-ПЦР (immuno-PCR - IPCR) является сверхчувствительным методом обнаружения белков и других антигенов [292-294]. Разработанный впервые Т. Сано и др. в 1992 г. метод иммуно-ПЦР обеспечивает ~ 1000-кратное увеличение чувствительности при детекции антигенов по сравнению с обычными им-муноферментными методами анализа (enzyme-linked immunosor-
bent assay - ELISA). В этой группе методов используют ковалентные конъюгаты фрагментов одноцепочечной или двухцепочечной ДНК с антителами или их генно-инженерными производными в качестве зондов к исследуемым антигенам (рис. 22, а). В таком варианте антиген, иммобилизованный на твердом носителе, инкубируют с антителами в виде конъюгатов с маркерным фрагментом ДНК. После отмывания избытка несвязавшегося конъюгата оставшийся ампликон обнаруживают с помощью ПЦР. Во второй модификации метода (рис. 22, б) иммуно-ПЦР используют для конкурентного обнаружения низкомолекулярных антигенов. В одном из таких случаев, иллюстрирующем принцип данного метода, свободный анализируемый гаптен конкурирует с конъюгатом гаптен-стрептавидин за сайты связывания в молекулах антител, иммобилизованных на твердой подложке. Конъюгат, оставшийся в связанном состоянии, определяется по присутствию маркерных фрагментов ДНК с помощью ПЦР.
Системы биотин-стрептавидин или биотин-авидин часто используются для формирования различных межмолекулярных комплексов. Авидин - белок куриного яйца, и его функциональный аналог, бактериальный белок стрептавидин из Streptomyces avidinii, образуют чрезвычайно прочные комплексы с авидином (формула изображена на рис. 22, в) с константой ассоциации ~1015. Использование стрептавидина в различных приложениях с нуклеиновыми кислотами предпочтительнее, чем авидина, поскольку его изоэлектрическая точка (pi) лежит вблизи 7,0, а следовательно при физиологических значениях pH неспецифическое взаимодействие этого белка с ДНК менее вероятно. Кроме того, молекулы стрептавидина не гликозилированы, что опять-таки предотвращает образование неспецифических комплексов. Молекулы биотина могут быть присоединены ковалентными связями к У- и 5'-концевым нуклеотидам нуклеиновых кислот, а также включены во внутренние части макромолекул в составе различных конъюгатов с дезоксирибонуклеозидтрифосфатами, один из которых изображен на рис. 22, в.
Стрептавидин является гомотетрамерным белком, содержащим четыре сайта связывания молекул биотина, по одному на каждой цепи. На рис. 22, г представлена схема самосборки олигомерных конъюгатов стрептавидин-ДНК из биотинилированных фрагментов ДНК и молекул стрептавидина. В этом примере фрагменты ДНК биотинилированы по обоим 5'-концам и, взаимодействуя с четырехвалентными молекулами стрептавидина, образуют трехмерные межмолекулярные сети. Анализ с помощью электрофореза и сканирующей силовой микроскопии пока-
в
ООО
II
-О-Р-1
Я
HN HN
о н4-Ьн
н
.р_0-р-0-Р-0п0 | о- о- о- г 7
он
Биотинилированный дезоксиуридинтрифосфат
рис. 22. Использование ДНК-белковых конъюгатов в иммуно-ПЦР [294]
а - обнаружение высокомолекулярных антигенов. Антиген, иммобилизованный на твердом носителе, взаимодействует с конъюгатом антитело-ДНК, после чего наличие маркерной ДНК в комплексе выявляют с помощью ПЦР; прямоугольник с восклицательным знаком указывает на важность этапа синтеза конъюгата для создания эффективной системы;
б - обнаружение низкомолекулярных гаптенов с помощью конкурентной иммуно-ПЦР. Анализируемый свободный гаптен конкурирует за иммобилизованные антитела с конъюгатом гаптен-стрептавидин-ДНК; по окончанию инкубации и отмывки несвязавшихся молекул маркерную ДНК обнаруживают с помощью ПЦР; b - сайты связывания биотина на гомотетрамерной молекуле стрептавидина, Гап - анализируемый гаптен, дуга изображает маркерную ДНК, меченную по обоим 5'-концам биотином, стрелки находятся на 3'-концах;
в - биотинилированный дезоксиуридинтрифосфат, используемый для введения биотиновой метки в молекулы ДНК в процессе их биосинтеза;
г - схема самосборки конъюгатов гаптен-стрептавидин-ДНК; 1 - стрепта-видин; 2 - фрагмент ДНК, меченный по 5'-концам биотином; 3 - олигомерный конъюгат стрептавидин-ДНК; 4 - наночастицы стрептавидин-ДНК, преимущественно образующиеся после термального разрушения комплексов 3\ 5 - комплекс наночастицы с конъюгатом биотин-гаптен; R - молекула гаптена; стрелки обозначают 3'-концы ДНК
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 221 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed