Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Зонды типа “висячий замок” (padlock probes) не имеют прямого отношения к ПЦР. Но они также, как и аллель-специфическая ПЦР, позволяют обнаруживать точковые мутации и находят применение в анализе неамплифицированной геномной ДНК, в том числе а-сателлитных последовательностей в центромерных участках метафазных хромосом человека [287]. Поэтому о них целесообразно упомянуть в этом разделе. Такие зонды представляют собой линейные олигонуклеотиды, концы которых, соединенные случайной последовательностью нуклеотидов, комплементарны анализируемому участку ДНК и после гибридизации с исследуемой ДНК сближаются настолько, что между ними остается только одноцепочечный разрыв, который может быть ликвидирован с помощью ДНК-лигазы [288]. После этого исходный олигонуклеотид превращается в кольцевую ковалентно замкнутую молекулу, через которую проходит цепь анализируемой ДНК. Циркуляризованные таким образом олигонуклеотиды далее могут быть использованы в качестве матриц в амплификации по типу катящегося кольца (rolling circle amplification - RCA) (см. раздел 6.6.3 этой главы), что позволяет увеличить количество молекул зонда до уровня, допускающего осуществлять анализ отдельных уникальных последовательностей нуклеотидов [289]. Дальнейшее внедрение экспоненциальной амплификации лигированных зондов с помощью разветвленной амплификации по типу катящегося кольца (branched RCA, bRCA) позволило проводить анализ замен отдельных нуклеотидов в плашках для микротитрования в гомогенной реакционной смеси при постоянной температуре [290].
6.3.10. ПЦР, чувствительная к метилированию матрицы
По крайней мере, семь интенсивных ковалентных модификаций азотистых оснований геномной ДНК обнаружены у живых организмов, относящихся к различным таксономическим группам, и биологические последствия этих явлений составляют предмет интенсивных исследований [291]. Одноклеточные эукариоты содержат Ы6-метиладенин (т6А) и 5-гидроксиметилурацил (hm5U). В клетках человека и насекомых были обнаружены т6А и ]М7-метилгуанин (m7G). У прокариот наиболее часто встречаются т6А и 5-метилцитозин (т5С), а также, в меньшей степени, №-метилцитозин (т4С). Все модификации связаны с системами рестрикции и модификации ДНК, а т6А, кроме того, участвует в контроле репликации и репарации ДНК у этих организмов. У бактериофага Т4 все остатки С представлены 5-гидроксиме-
сн3
>|г >|г >1г
5'-
С ¦ G
С
G
m
1
-С
G
С ¦ G-
м м
Рестрикция, чувствительная к СН3-группам Рестрикция, нечувствительная к СН3-группам
I
5'-
•U
U
m
U
V
V
ПЦР (удлинение праймера)
I
5'-
•U
U
m
5'
------А-----А------G -
I
ПЦР (амплификация) I
U
А
Секвенирование ДНК
+ Бисульфит натрия
С Т
• Бисульфит натрия
m
Электрофорез Гибридизация по Саузерну
ПЦР
Электрофорез
о
о
К
--- X ---
о
_Э_
Сц
СО
о
о-
С
3'
Денатурация + Бисульфит натрия
3'
3'
Т - Т.........С --------Т------------3'
А----------А--------------G *-А —
Рис. 21. Определение статуса метилирования ДНК с использованием рестриктазы, чувствительной к метилированию (а) или бисульфита натрия с последующей аллель-специфической ПЦР (б) [291]
а - исследуемую ДНК инкубируют с рестриктазой, чувствительной или нечувствительной к метилированию ДНК, и анализируют гибридизацией по Саузерну (внизу слева) или с помощью ПЦР (внизу справа);
б - после денатурации исследуемая ДНК инкубируется с бисульфитом натрия, что сопровождается дезаминированием остатков С и их превращением в U; статус метилирования анализируемого четырехнуклеотидного участка определяют после его амплификации и секвенирования продукта ПЦР, результаты которого изображены в виде секвенирующего геля внизу рисунка
тилцитозином (hm5C) или гликозилированными hm5C, а у растений до 50% остатков С метилированы (ш5С). Вообще, последняя модификация наиболее часто встречается у эукариот с размером генома > 108 п.о. (т.е. у животных и растений), но редка у организмов с меньшим геномом (в том числе дрожжей, двукрылых насекомых и нематод). Хотя в клетках млекопитающих только 3-10% остатков С метилированы, данная модификация играет большую роль в функционировании их генома. У этих организмов образование т5С ассоциировано с регуляцией транскрипции, в том числе инактивацией Х-хромосом, импринтингом, дифференциров-кой клеток и различными патологическими процессами, включая канцерогенез.
Как уже упоминалось, одним из простых и эффективных методов обнаружения метилированных остатков С и А в ДНК является использование эндонуклеаз рестрикции, чувствительных к метилированию (ЭРЧМ) (см. раздел 2.2) (рис. 21, а). В этом случае инкубация изучаемой ДНК с ЭРЧМ в зависимости от статуса метилирования исследуемого участка может приводить или не приводить к разрушению ампликона и подавлению его амплификации в ПЦР. Однако, поскольку не всегда в нужных местах генома присутствуют соответствующие сайты рестрикции, применение таких ферментов имеет ограничения. При другом распространенном подходе, лишенном этого недостатка, используют способность бисульфита (HSO3) превращать в оц ДНК остатки С
