Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
При клонировании in silico на основании гомологии с полу-
ченной последовательностью необходимо прежде всего найти в базе данных подходящий EST-маркер. Это осуществляется с помощью определенного алгоритма, например BLAST, с использованием различных интерфейсов, среди которых в настоящее время популярен, находящийся на сайте Центра биотехнологической информации (Center for Biotechnology Information -NCBI http://www.ncbi.nih.gov/BLAST). Сделав запрос в форме нуклеотидной или аминокислотной последовательности, убеждаются в наличии или отсутствии в базе данных идентичной или гомологичной последовательности EST. Путем организации таких запросов можно выяснить, экспрессируется ли обнаруженная экспериментально последовательность в клетках, и в случае положительного ответа на вопрос использовать эти данные для позиционного клонирования целого гена (см. ниже). После выявления в базе данных EST, гомологичного исследуемой последовательности, необходимо убедиться в наличии или отсутствии данных о последовательности нуклеотидов другого конца выявленной мРНК, а также о перекрывающихся с ними последовательностях. Перекрывающиеся последовательности в базах данных кластеризованы, и к ним имеется быстрый доступ. При удачном стечении обстоятельств экспериментально полученную последовательность, полученную путем объединения перекрывающихся последовательностей, удается поместить в контиг, который заключает в себе всю последовательность мРНК, т.е. завершить виртуальное клонирование целой кДНК.
Позиционное клонирование
По-прежнему уникальной задачей, которая по плечу лишь большим международным коллективам, остается клонирование неизвестных генов животных и растений, функционирование которых можно заметить по сложным фенотипическим признакам, например, симптомам системного наследственного заболевания. При выделении таких генов из генома человека работа начинается с проведения скрупулезного анализа сцепления исследуемого фенотипического признака и какого-либо полиморфного молекулярного маркера, например, редкого аллеля HLA или миниса-теллитного локуса всех членов семьи больного. После обнаружения сцепленных маркеров задача сводится к клонированию крупных фрагментов ДНК, включающих эти маркеры, их секвениро-ванию, выявлению открытых рамок считывания, в которых пытаются обнаружить мутации, отсутствующие у здоровых индивидуумов. В случае удачи дальнейшая работа может проводиться
по одной из вышеприведенных схем и должна закончиться идентификацией гена и его белкового продукта.
Примерно такой, но на самом деле намного более сложный, путь исследований в генной инженерии привел за последние 30 лет к клонированию множества генов, в том числе и неизвестных ранее, определению их структуры и особенностей функционирования. Аналогичные подходы легли в основу многих новых направлений молекулярной биологии и генетики. Об использовании этих методов при целенаправленном конструировании рекомбинантных белков речь пойдет во второй части книги.
Литература
1. Matic /., Taddei F., Radman M. Genetic barriers among bacteria I I Trends Microbiol. 1996. Vol. 4. P. 69-72.
2. Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия. М.: Наука,
1989. 254 с.
3. Лъюин Б. Гены. М.: Мир, 1987. 544 с.
4. Жиму лев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2003. 480 с.
5. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1967. 461 с.
6. Duret L. Why do genes have introns? Recombination might add a new piece to the puzzle // Trends Genet. 2001. Vol. 17. P. 172-175.
7. Logsdon J.M., Jr. The recent origins of spliceosomal introns revisited // Curr. Opin. Gen. Develop. 1998. Vol. 8. P. 501-508.
8. Sharp P.A. Split genes and RNA splicing // Cell. 1994. Vol. 77. P. 805-815.
9. SmitA.F.A. The origin of interspersed repeats in the human genome // Curr. Opin. Genet. Develop. 1996. Vol. 6. P. 743-748.
10. Britten RJ., Graham D.E., Neufeld B.R. Analysis of repeating DNA sequences by reassociation I I Meth. Enzymol. 1974. Vol. 29. P. 363-418.
11. Petrov D.A. Evolution of genome size: New approaches to an old problem // Trends Genet. 2001. Vol.17. P. 23-28.
12. Gray M.W. Evolution of organellar genomes // Curr. Opin. Genet. Develop.
1999. Vol. 9. P. 678-687.
13. Martin W., Stobe B., Goremykin V. et al. Gene transfer to the nucleus and the evolution of chloroplasts // Nature. 1998. Vol. 393. P. 162-165.
14. Lang B.F., Gray M.W., Burger G. Mitochondrial DNA evolution and the origin of eukaryotes // Annu. Rev. Genet. 1999. Vol. 33. P. 351-397.
15. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М.: Наука, 2000. 528 с.
16. Woose C.R., Kandler О., Wheelis М. Towards a natural system of organisms: Proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87. P. 4576-4579.
17. Lander E.S., Linton L.M., Birren B. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome I I Nature. 2001. Vol. 409. P. 860-921.
18. Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W. et al. The sequence of the human genome // Science. 2001. Vol. 291. P. 1304-1351.
