Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
ЛЦР не происходит в том случае, если З'-концевой нуклеотид первого олигонуклеотида или 5'-концевой нуклеотид второго некомплементарны соответствующим нуклеотидам ДНК. Поэтому при наличии мутации в тех сайтах ДНК, где олигонуклеотиды стыкуются друг с другом, в реакцию со своим партнером вступает только измененный олигонуклеотид, полностью комплементарный мутантной ДНК, т.е. продукт реакции образуется лишь при наличии в реакционной смеси “мутантного” олигонуклеотида, но не олигонуклеотида дикого типа. Таким образом, принципы, лежащие в основе метода определения мутаций с помощью ЛЦР, в ряде существенных моментов идентичны принципам ал-лель-специфической ПЦР.
Для количественной оценки ЛЦР один из олигонуклеотидов обычно метят биотином, а другой (соответствующий мутантному аллелю) - с помощью радиоактивной или флуоресцентной метки. По завершении ЛЦР олигонуклеотиды, меченные биотином, связывают с мембранными фильтрами с иммобилизованным стрептавидином, а количество лигированных олигонуклеотидов определяют по количеству связавшейся с фильтрами радиоактивной или флуоресцентной метки после отмывки непрореагировавших олигонуклеотидов.
6.6.2. Изотермические системы
амплификации нуклеиновых кислот,
основанные на транскрипции
Изотермическая самоподдерживающаяся репликация последовательностей (isothermal self-sustained sequence replication -3SR) [324]. При использовании этого метода амплификации нуклеотидных последовательностей РНК является наиболее предпочтительной исходной матрицей, хотя молекулы ДНК также могут выполнять эту функцию. В последнем случае молекулы ДНК копируются с помощью праймеров, содержащих промотор для РНК-полимеразы, например, Т7-РНК-полимера-зы, которая далее используется для получения копии РНК с ДНК-матрицы. Комплементарная цепь ДНК амплифицируемой РНК синтезируется в процессе обратной транскрипции с участием РНК-зависимой ДНК-полимеразы вируса миелобластоза птиц (AMV), которая начинает синтез с праймера, содержащего промотор для Т7-РНК-полимеразы. Обратная транскриптаза AMV обладает активностью РНКазы Н, которая специфически удаляет цепь РНК из образовавшегося дуплекса ДНК-РНК. В результате образуется одноцепочечная ДНК, комплементарная исходной РНК. После этого в дело идет второй праймер, комплементарный этой ДНК, который используется для синтеза второй цепи ДНК обратной транскриптазой (рис. 28, а). По завершению синтеза второй цени ДНК образовавшаяся молекула уже содержит промотор для Т7-РНК-полимеразы, так что этот фермент может быть использован далее для синтеза множества копий РНК с этой матрицы, которые комплементарны исходной РНК (рис. 28, б).
Начиная с этого момента, обратная транскриптаза начинает циклически синтезировать цепи ДНК на РНК-матрицах, расщеплять молекулы РНК в гибридах и превращать их в двухцепочечные молекулы, которые, в свою очередь, начинают служить матрицами для Т7-РНК-полимеразы для синтеза новых копий одноцепочечных РНК. Замечательным свойством данной системы является возможность осуществления всех этих реакций одновременно и при одной постоянной температуре. В итоге имеет место самоподдерживающаяся амплификация исходной последовательности РНК, специфичность которой задается первичной структурой используемых праймеров.
Амплификация с замещением цепи ДНК (strand displacement amplification - SDA). По своей идеологии амплификация с замещением цепи очень близка к только что рассмотренному методу
5'
3'
Амплифицируемая РНК 15’ ДНК
Обратная транскрипция/РНКаза Н
Амплифицируемая РНК 15' ДНК
3'
s' cm-в
15' ДНК
3'
5'CZZ1-
| Синтез второй цепи ДНК 15' ДНК
3'
5'
15' дак ДНК
Рис. 28. Изотермическая самоподдерживающаяся репликация последовательностей [311]
а - реакцию начинают с синтеза двухцепочечной ДНК на матрице ампли-фицируемой РНК с помощью обратной транскриптазы; для синтеза первой цепи ДНК используют праймер, специфичный в отношении 3'-конца анализируемой РНК, содержащий промотор для Т7-РНК-полимеразы (прямоугольник, правая часть которого окрашена), вторую цепь синтезируют тем же ферментом с праймера В;
б - в фазе амплификации синтезированную двухцепочечную ДНК транскрибируют Т7-РНК-полимеразой, а образующиеся РНК циклически превращают в двухцепочечную ДНК той же обратной транскриптазой с помощью вышеупомянутых праймеров; эта ДНК вновь транскрибируется Т7-РНК-полимера-зой и т.д.
SSR-амплификации, хотя и отличается от него рядом деталей (рис. 29) [325-327]. В данном методе используются особые свойства рестриктазы BsoB 1, которая распознает гексануклеотидный сайт рестрикции и расщепляет его по следующему механизму: CnLtCGGG. Показано, что введение в сайт рестрикции а-тио-групп вместо соответствующего фосфата помощью a-S-dCTP не остается незамеченным ферментом и он перестает расщеплять тиоэфирную связь. Аналогичными свойствами обладает рестриктаза Hincll (GTTnUjAC). Однако, в этом случае, если включение производного происходит в верхнюю цепь ДНК в сайте рест-
