Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Добавление в реакционную смесь с кольцевой ДНК в качестве матрицы второго встречного праймера делает RCA-амплификацию экспоненциальной в изотермических условиях [331]. Экспоненциальная RCA была использована для обнаружения линейных молекул ДНК с использованием зондов типа “висячий замок”, принцип действия которых уже рассматривался выше [335].
Как видно из всего представленного в этой главе материала, в последние несколько лет было разработано много новых подходов амплификации последовательностей нуклеиновых кислот как с помощью различных вариантов ПЦР, так и альтернативных методов, включая изотермическую амплификацию. Методы амплификации, с помощью которых в ряде случаев можно заменять традиционное клонирование и осуществлять детекцию специфических последовательностей, становятся все менее трудоемкими, более быстрыми и чувствительными. Прослеживается тенденция к автоматизации всех указанных процессов. Метод ПЦР стал незаменимым в молекулярно-генетических исследованиях, и пока не видно предела его дальнейшему совершенствованию и развитию.
Заключение. Стратегия выделения нового гена
После обсуждения основных экспериментальных приемов, используемых в современной генной инженерии, становится ясно, каким образом можно решить одну из основных методических задач молекулярной генетики, а именно: выделить требуемый ген и заставить его работать в новых для него (искусственных) генетических условиях. Такая задача наиболее просто решается в случае бактериальных и вирусных генов, поскольку геном этих микроорганизмов невелик. Кроме того, бактериальные гены, как правило, не содержат интронов и даже гетерологичные бактериальные гены хорошо экспрессируются в клетках Е. coli. Но и клонирование эукариотических генов в настоящее время представляется вполне посильной задачей.
Стандартный подход
Приняв решение о клонировании какого-либо эукариотического гена, прежде всего необходимо ответить на вопрос: нужна ли экспрессия рекомбинантного гена в клетках микроорганизмов или же можно ограничиться исследованием его структуры? Очевидно, что в первом случае нужно думать о создании клонотеки безинтронных кДНК, а во втором - клонотеки геномной ДНК исследуемого объекта, что в ряде случаев технически менее сложно. Задача становится более трудной, если отсутствуют сведения о первичной структуре клонируемого гена. Тогда единственным источником получения частичной информации о последовательности его нуклеотидов может быть кодируемый этим геном белок.
Определив последовательность нескольких N-концевых аминокислот белка, можно в соответствии с генетическим кодом синтезировать ряд олигонуклеотидных зондов и использовать их для скрининга клонотеки генов. В этом случае удобнее использовать экспрессирующую клонотеку кДНК, так как для получения необходимой информации нужно будет исследовать меньшее количество клонов. Действительно, в клонотеках кДНК отсутствует большинство некодирующих последовательностей нуклеотидов, суммарная длина которых может значительно (на два-три порядка) превышать таковую значимых последовательностей. Однако при использовании таких клонотек особенно остро встает вопрос об их репрезентативности, поскольку внутриклеточное содержание индивидуальных мРНК сильно различается в клетках разных тканей. После выделения рекомбинантной ДНК, гибридизующей-ся с упомянутыми выше олигонуклеотидными зондами, можно
идентифицировать кодируемый кДНК белок после ее экспрессии с использованием специфических антител. Альтернативно: кодирующий потенциал клонированной кДНК определяют после ее гибридизации с суммарной мРНК, выделяя фракцию мРНК, задерживаемой иммобилизованной кДНК на носителе, с последующей трансляцией мРНК в бесклеточной белоксинтезирующей системе. Кроме того, если клонированная кДНК кодирует мРНК исследуемого белка, то они и в растворе образуют специфический ДНК-РНК-гибрид, и мРНК перестает участвовать в трансляции в бесклеточной системе (метод прерванной трансляции). Наличие или отсутствие белкового продукта бесклеточной трансляции легко обнаружить с помощью специфических антител. После проведения таких исследований можно точно идентифицировать клонированную кДНК и использовать ее в качестве зонда для выделения целого гена из клонотеки геномной ДНК. Одновременно возможна экспрессия клонированной к ДНК в клетках микроорганизмов или в гомологичных эукариотических клетках.
Клонирование in silico
Попытки клонирования кДНК редко завершаются выделением клона, который бы заключал в себе полную последовательность мРНК, послужившей матрицей при синтезе этой макромолекулы с помощью обратной транскрипции. В ряде случаев идентифицировать новый клон и выяснить его полноразмерную последовательность можно с помощью методов современной биоинформатики, не прибегая к дальнейшим генно-инженерным манипуляциям [335]. В частности, можно провести компьютерный поиск гомологичной последовательности в базах данных EST-no-следовательностей, доступных через Интернет.
Маркеры экспрессирующихся последовательностей - EST (expressed sequence tags) - представляют собой последовательности нуклеотидов, полученные при секвенировании 5'- и З'-кон-цевых последовательностей кДНК случайно выбранных клонов, длина которых обычно не превышает 1,5 т.п.о. Такие клоны можно получить, например, с использованием быстрой амплификации концов к ДНК (rapid amplification of cDNA ends - RACE). Базы данных, насчитывающие в настоящее время миллионы этих последовательностей, каждой из которых присвоен уникальный идентификационный номер, являются мощным инструментом идентификации и поиска новых генов, особенно в сложноустроенных геномах эукариот.
