Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Подготовка анализируемой ДНК
/‘
(О s,
U)
Денатурация (95°С) Отжиг праймеров (52°С)
(*)
Комплементарные
праймеры
(2)
ДНК-полимераза
V)
В,------------------
Амплифицируемая область ДНК
dUTP, dATP thiodCTP, dGTP
(<5)
Puc. 29. Амплификация с замещением цепи [325]
При подготовке матрицы (верхняя часть рисунка) амплифицируемую ДНК (7) отжигают с двумя праймерами В ] (bumper) и S ], содержащим сайт рестрикции BsoBl, которые далее элонгируют ДНК-полимеразой в присутствии четырех dNTPs, в том числе тио-лированного dCTP (2); цепь, инициированная с праймера В], вытесняется из дуплекса (3, 4) и может быть использована в качестве матрицы во время синтеза ДНК с новых праймеров В2 и S2 (5); образовавшаяся в итоге двухцепочечная ДНК (6) в отличие от исходной содержит сайт рестрикции ВбоШ.
В экспоненциальной фазе реакции (нижняя часть рисунка) рестриктаза ZtooBI вносит одноцепочечный разрыв (обозначен треугольником) в верхнюю цепь ДНК, синтез которой был инициирован с праймера S], но не в нижнюю цепь, поскольку последняя содержит в сайте рестрикции модифицированный остаток dCMP (7); наличие одноцепочечного разрыва позволяет ДНК-полимеразе (обозначена звездочкой) инициировать синтез ДНК в этом месте и построить новую цепь ДНК, вытеснив дочернюю из дуплекса, при этом происходит восстановление немодифицированного сайта рестрикции, который по-прежнему остается измененным в нижней цепи (8-10), что дает возможность образованному дуплексу вступить в новый цикл синтеза ДНК, а вытесненная цепь также используется в качестве матрицы вначале с праймерами В2 и S2, а затем В] и Sj, что обеспечивает экспоненциальный характер амплификации
Экспоненциальная амплификация участка ДНК
(б).
CTCGGG 'GAGCCC¦
(8)
(7)
<Vtcggg-
¦ GAGCCC¦
(?)
|ДНК-полимераза^
c*Gcb. GAGCCC ¦
-С/
О,
G
CUCGGG
GAGCCC
C,
G
НОВЫЙ цикл
(10).
CUCGGG
GAGCCC
рикции, модифицированный сайт расщепляется эндонуклеазой как обычно. Если же изменяется нижняя цепь сайта, то фермент перестает его расщеплять. Как это свойство рестриктазы BsoB 1 используется для осуществления изотермической амплификации ДНК иллюстрирует нижняя часть рис. 29.
Для синтеза ДНК при SDA-амплификации используют термостабильную Bst-ДНК-полимеразу, у которой отсутствует 5'->3'-экзонуклеазная активность. Такой фермент осуществляет вытеснение цепи ДНК из дуплекса при замене ее вновь синтезируемой в результате полимеризации четырех дезоксирибо-нуклеозидтрифосфатов. После денатурации ДНК с ней отжигают два праймера, один из которых (S,) содержит на 5'-конце сайт BsoBl, некомплементарный матрице, а другой (В,), полностью комплементарный матрице, выполняет роль “буфера”, вытесняя 5'-конец праймера Sj (этап 1). Праймеры Bj и S, начинают одновременно удлиняться ДНК-полимеразой в присутствии a-S-dCTP и остальных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, что приводит к синтезу двух почти идентичных комплементарных цепей ДНК, из которых одна без сайта рестрикции остается в дуплексе, а другая, содержащая новый сайт рестрикции BsoBl, введенный с помощью праймера Sb вытесняется в реакционную смесь (этапы 3 и 4). Вытесненная цепь может далее ги-бридизоваться с комплементарными ей праймерами S2 и В2 (этап 5), элонгация которых приводит к образованию двухцепочечного продукта реакции (6), участвующего далее в фазе экспоненциальной амплификации. Механизм амплификации схематически представлен в нижней части рисунка.
В фазе экспоненциальной амплификации рестриктаза BsoBl вносит одноцепочечный разрыв в верхнюю цепь ДНК, в которой сайт рестрикции был создан праймером S, и не содер-
-------->-
Рис. 30. Амплификация последовательностей геномной РНК вируса иммунодефицита человека [311] Qp-репликазой [162]
РНК анализируемого образца гибридизуют с зондами двух типов: полири-бонуклеотидами MDV и олигодезоксирибонуклеотидами, биотинилированны-ми по своим концам; все зонды специфичны в отношении анализируемой РНК; после встречи с ВИЧ-РНК зонды образуют с ней специфические гибриды, которые отделяют от остальных компонентов смеси аффинной хроматографией на носителе с иммобилизованным стрептавидином; связавшиеся с носителем комплексы элюируют РНКазой Н, которая гидролизует РНК только в ДНК-РНК-гибридах, и инкубируют с Т4-ДНК-лигазой, что приводит к объединению двух MDV-зондов, после чего они могут быть транскрибированы QP-реплика-зой; каждый из зондов по отдельности не может быть использован этим ферментом в качестве матрицы
РНКаза Н 1 1 1
Гибридизация
Иммобилизация
Промывание
